結(jié)腸癌細(xì)胞中腺病毒介導(dǎo)的Bcl-XL shRNA增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.pdf

1、【背景和目的】:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子(TNF)基因超家族的成員之一,它能通過死亡受體(death receptor,DR)途徑引起細(xì)胞凋亡。之前有報(bào)道,TRAIL能夠選擇性地引起多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,但對(duì)多數(shù)正常細(xì)胞沒有明顯毒性作用,這提示TRAIL在腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前,重組型

2、TRAIL蛋白和TRAIL受體單抗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)中,它們具有良好的抗腫瘤效果和溫和的毒副作用,這一結(jié)果令人振奮。然而,很多腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL具有耐受性,這就需要我們聯(lián)合其它治療方法增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。我們之前報(bào)道Bcl-XL siRNA能夠增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。但是在體內(nèi)傳遞化學(xué)合成的siRNA仍然是RNA干擾治療手段發(fā)展的重要障礙。為此我們構(gòu)建了在U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下能夠表達(dá)Bcl-XL靶向的小發(fā)夾RNA(B

3、cl-XL shRNA)的腺病毒Ad/Bcl-XL shRNA。在本項(xiàng)研究中我們的主要目標(biāo)是檢測(cè)聯(lián)合用藥時(shí),Ad/Bcl-XL shRNA能否增強(qiáng)Ad/gTRAIL在結(jié)腸癌細(xì)胞包括TRAIL耐藥細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡。
　　【材料和方法】:用293細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中的各種重組腺病毒(Ad/CMV-GFP,Ad/gTRAIL,Ad/Bcl-XL shRNA),通過氯化銫密度梯度離心法純化腺病毒,OD260和TCID50的方法分別測(cè)定病毒液濃度

4、和滴度;用Ad/gTRAIL反復(fù)處理DLD1細(xì)胞篩選得到TRAIL耐受的DLD1-R細(xì)胞;用MTT方法測(cè)定細(xì)胞相對(duì)活性;用Westernblot的方法測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;實(shí)驗(yàn)中PBS組作為空白對(duì)照,Ad/CMV-GFP作為載體對(duì)照:用方差分析的方法比較各組的差異。
　　【結(jié)果】:聯(lián)合使用Ad/gTRAIL和Ad/Bcl-XL shRNA能明顯抑制TRAIL敏感的結(jié)腸癌細(xì)胞系DLD1和Lovo的生長(zhǎng),與單藥相比聯(lián)合用藥顯著增

5、強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡,具有協(xié)同作用;用Ad/gTRAIL反復(fù)處理DLD1會(huì)導(dǎo)致獲得性TRAIL耐藥,得到TRAIL耐藥的DLD1-R細(xì)胞,在該細(xì)胞中Bcl-XL表達(dá)明顯增高;進(jìn)一步研究提示聯(lián)合Ad/gTRAIL和Ad/Bcl-XL shRNA可以逆轉(zhuǎn)DLD1-R的TRAIL獲得性耐藥,增強(qiáng)TRAIL對(duì)caspase-8、caspase-9、caspase-3、PARP及BID的激活作用;聯(lián)合治療還明顯增強(qiáng)了細(xì)胞色素c的釋放。
　　【結(jié)論