小鼠巨細(xì)胞病毒感染對(duì)乳鼠海馬突觸數(shù)目及突觸相關(guān)蛋白的影響研究.pdf

1、第一部分 MCMV 感染對(duì)乳鼠海馬突觸數(shù)目及突觸相關(guān)蛋白的影響
　　 目的：研究MCMV 感染對(duì)乳鼠海馬神經(jīng)元突觸數(shù)目及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：①體外細(xì)胞培養(yǎng)法傳毒增殖MCMV Smith 毒株，Reed-Muench 法計(jì)算病毒毒力。②建立乳鼠腦組織MCMV 感染模型：ELISA 法篩選MCMV IgM和IgG 均為陰性的BALB/C 小鼠，雌雄小鼠同籠受孕。仔鼠出生當(dāng)天，按窩隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)

2、組（n=90）顱內(nèi)接種MCMV 病毒懸液10μl，對(duì)照組（n=90）顱內(nèi)接種等量的細(xì)胞維持液。無(wú)菌采集接種后3d、15d、30d 腦組織各30只，應(yīng)用PCR法檢測(cè)其MCMV 感染情況，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)MCMV DNA陽(yáng)性以及對(duì)照組內(nèi)MCMV DNA陰性腦組織用于后續(xù)試驗(yàn)。③應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記SYP，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組乳鼠海馬SYP 熒光顆粒數(shù)目，以此代表突觸數(shù)目。④應(yīng)用Real-time qPCR、免疫組織化學(xué)方法及Western b

3、lot 法檢測(cè)各組乳鼠海馬突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95及AMPA受體GluR2 亞基的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：MCMV ① Smith 毒株的TCID50 為10-4.5/0.1ml。②實(shí)驗(yàn)組小鼠腦組織中均可檢見(jiàn)MCMV DNA，對(duì)照組小鼠腦組織中未檢見(jiàn)MCMV DNA。③隨日齡增加，兩組乳鼠海馬SYP 熒光顆粒數(shù)目不斷增加；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相乳鼠海馬SYP熒光顆粒數(shù)目均減少，其中第15d和第

4、30d 減少更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④
　　 隨日齡增加，兩組乳鼠海馬SYP、PSD-95及AMPA 受體GluR2 亞基編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均不斷增高；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均降低，其中，第15d和第30d下降更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：①M(fèi)CMV 感染可導(dǎo)致發(fā)育中的乳鼠海馬突觸形成數(shù)目減少，并且隨著日齡的增加，其影響更為明顯。②MCMV 可

5、導(dǎo)致發(fā)育過(guò)程中的乳鼠突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95及AMPA 受體GluR2 亞基的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降。
　　 第二部分 MCMV 感染后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)元突觸的影響
　　 目的：研究MCMV 感染后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)物對(duì)神經(jīng)元突觸數(shù)目及突觸相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：①建立星形膠質(zhì)細(xì)胞MCMV感染模型：原代及傳代培養(yǎng)乳鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞特

6、異性標(biāo)記物GFAP的表達(dá)情況，鑒定并檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度；以100TCID50 MCMV攻擊星形膠質(zhì)細(xì)胞后，通過(guò)PCR檢測(cè)MCMV DNA、觀察細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)NIH 3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒作用、CCK-8法檢測(cè)MCMV對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響，以及繪制MCMV在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)曲線等方法，判定星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)MCMV的易感性、感染狀態(tài)以及MCMV在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)情況。②建立星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液（Astrocyte conditioned m

7、edium，ACM）與神經(jīng)元共培養(yǎng)體系：原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)元；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NSE的表達(dá)情況，鑒定并檢測(cè)神經(jīng)元的純度；以100TCID50 MCMV攻擊傳代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，收集MCMV感染后6、12、24、48、72h以及相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組ACM，過(guò)濾及離心后用紫外燈照射15min滅活CMV；應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)不同濃度ACM對(duì)神經(jīng)元存活的影響，以確定最佳的ACM濃度應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；根據(jù)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液

8、各組分不同，分為實(shí)驗(yàn)組（含最佳濃度的各不同時(shí)間點(diǎn)感染ACM）、ACM對(duì)照組（含最佳濃度的各不同時(shí)間點(diǎn)正常ACM）及空白對(duì)照組（不含ACM）。③應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記SYP，并在熒光顯微鏡下觀察各組神經(jīng)元突觸數(shù)目，以此代表突觸數(shù)目。④應(yīng)用Real-time qPCR及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)各組神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95及AMPA受體GluR2亞基的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：①體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞（純度達(dá)9

9、5％以上）感染MCMV后發(fā)生典型細(xì)胞病變；在MCMV 感染48h的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到MCMV IE DNA的表達(dá)；
　　 感染后3d~4d的ACM 可使NIH 3T3細(xì)胞發(fā)生典型的CMV 病毒蝕斑；星形膠質(zhì)細(xì)胞在感染MCMV后24h 開(kāi)始死亡，感染后72h 大部分細(xì)胞死亡，至感染后96h細(xì)胞幾乎全部死亡；MCMV在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制于感染后12h 開(kāi)始增高，72h 達(dá)到高峰。
　　 ②體外培養(yǎng)神經(jīng)元的純度可達(dá)98

10、％以上，培養(yǎng)基含50％ACM 時(shí)神經(jīng)元存活率最高。
　　 ③與空白對(duì)照組相比，ACM 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組12h~72h SYP 熒光顆粒數(shù)目均明顯增多（P<0.01）；與ACM 對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組12h~72h SYP 熒光顆粒數(shù)目均明顯減少（P<0.01）。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，ACM 對(duì)照組12h、24h、48h SYP 熒光顆粒數(shù)目均比前一時(shí)相明顯升高（P<0.01），72h 變化不明顯（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組僅12h SYP 熒光顆

11、粒數(shù)比前一時(shí)相明顯升高（P<0.01），24h、48h、72h 變化不明顯（P>0.05）。④與空白對(duì)照組比較，ACM 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組12~72h 三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與ACM 對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組12~72h 三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，ACM 對(duì)照組12h、24h、48h 三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均比前一時(shí)相明顯

12、升高（P<0.01），72h 變化不明顯（P>0.05）；實(shí)驗(yàn)組僅12h 三種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均比前一時(shí)相明顯升高（P<0.0.1），24h、48h、72h 變化不明顯（P>0.05）。
　　 結(jié)論：①M(fèi)CMV 可在傳代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、產(chǎn)毒并產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)。②星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌物可促進(jìn)突觸形成，MCMV 可能通過(guò)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的合成及分泌功能而使突觸形成減少。③星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌物可促進(jìn)神經(jīng)元突

13、觸相關(guān)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)，MCMV 可能通過(guò)影響星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌功能而干擾神經(jīng)元突觸相關(guān)蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　 第三部分 MCMV 感染對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞合成分泌TSP-1 及TNF-α的影響
　　 目的：研究MCMV 對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞合成分泌TSP-1 及TNF-α的影響。
　　 方法：傳代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組加入100 TCID50MCMV 及細(xì)胞維持液，對(duì)照組加

14、入細(xì)胞維持液。收集6、12、24、48、72h的細(xì)胞和ACM，ACM 過(guò)濾及離心后用紫外燈照射15min 滅活CMV。①應(yīng)用Real-time qPCR及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)MCMV 感染對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞TSP-1、TNF-αmRNA 及蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。②應(yīng)用ELISA 法檢測(cè)MCMV 感染對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TSP-1 及TNF-α的影響。
　　 結(jié)果：①與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相TSP-1 及TNF-αmRNA 及蛋白質(zhì)表

15、達(dá)水平均降低（P 均<0.01）；感染時(shí)間越長(zhǎng)，表達(dá)水平越低，差異越大。組內(nèi)比較發(fā)現(xiàn)，感染組12h~72h表達(dá)水平均低于前一時(shí)相（P 均<0.05）。②星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)12h后才能在ACM中檢測(cè)到TSP-1 及TNF-α；對(duì)照組TSP-1 及TNF-α含量在48h 內(nèi)迅速升高（與前一時(shí)相比較，P 均<0.05），72h 升高速度減慢；與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)相TSP-1 及TNF-α含量均減少（P 均<0.01），且12h~72h 含量