一種天然藥物的抗艾滋病毒研究.pdf

1、因艾滋病在全球傳播范圍很廣，其防治已成為一個國際性的重大課題。目前，由于HIV病毒的易變性，缺乏適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ?，疫苗研制也面臨很大困難，現(xiàn)有抗病毒的治療藥物尚不能從根本上殺滅病毒，同時對患者免疫系統(tǒng)也造成很大的破壞。故在世界范圍內(nèi)尋找抗艾滋病病毒（HIV）的天然藥物研究正在蓬勃開展。
　　本研究是在前期抗病毒活性篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上，以天然產(chǎn)物經(jīng)一定工藝制成的藥物KFY為研究對象，以感染HIV病毒的MT4和PBMC細(xì)胞為細(xì)胞模型，以健

2、康小鼠和免疫抑制小鼠為動物模型，研究了兩種加藥方式下本品和含藥血清的抗艾滋病毒作用和對動物免疫系統(tǒng)的作用；探索了本品對PBMC細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響、對gp120及其不同受體區(qū)域結(jié)合的影響、對HIV DNA及RNA的影響以及對HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的影響等抗病毒機(jī)理，為本品臨床研究和進(jìn)一步尋找抗HIV前藥提供依據(jù)，同時建立抗HIV試驗(yàn)平臺為類似的抗艾滋病毒藥物的研究提供思路。主要結(jié)果與結(jié)論如下:
　　一、藥效學(xué)研究
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3、學(xué)研究
　　采用先加藥后病毒感染后的方式，KFY對MT4和PBMC細(xì)胞中的HIV-1病毒復(fù)制的治療指數(shù)分別為16.6±2.9和10.0±2.0；采用先病毒感染后加藥的方式，1％KFY對已感染PBMC細(xì)胞培養(yǎng)上清中和細(xì)胞裂解液中HIV-1復(fù)制均有顯著抑制作用；血清抗病毒研究將81ml.kg-1KFY經(jīng)口給予大鼠（按體表面積系數(shù)計(jì)算相當(dāng)于30倍人等效劑量），分離血清，去血清蛋白的KFY含藥血清干粉對MT4細(xì)胞中HIV復(fù)制治療指數(shù)在11

4、.8~14.8之間(平均13.3)。提示KFY對MT4細(xì)胞和PBMC細(xì)胞中HIV-1 SF33病毒復(fù)制有抑制作用。
　　另外考察了KFY中4種組分抗HIV的相互作用，試驗(yàn)測定不同濃度藥物組分單用及合用后抗病毒抑制率，利用CombiDrug軟件的中效原理設(shè)計(jì)和計(jì)算合用指數(shù)CI值。結(jié)果顯示，AB組分合用時以協(xié)同為主，大劑量趨向相加；CD組分合用小劑量拮抗，大劑量趨向相加；但ABCD四組分合用有很強(qiáng)的協(xié)同作用，提示ABCD組分在此配比下

5、在MT4細(xì)胞中的抗病毒作用為協(xié)同關(guān)系。
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　　對健康小鼠免疫細(xì)胞功能影響：小鼠用藥1周后，與對照組比較，不同劑量KFY組動物外周血白細(xì)胞數(shù)量及各淋巴細(xì)胞亞群無明顯差異；KFY可提高ConA和LPS刺激后淋巴細(xì)胞的增殖功能；顯著增強(qiáng)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能及巨噬細(xì)胞IL-1β的分泌。
　　對環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠免疫細(xì)胞功能影響：經(jīng)口給予KFY一周后，KFY對外周血白細(xì)胞數(shù)量下降有保護(hù)作

6、用；對小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群和淋巴細(xì)胞增殖無明顯影響；能增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β分泌。提示KFY對外周血白細(xì)胞下降、腹腔巨噬細(xì)胞IL-1β分泌功能具有明顯的保護(hù)作用。
　　二、機(jī)理研究
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　　采用3個健康人PBMC為試驗(yàn)材料，觀察KFY對細(xì)胞生長及抗HIV-1 SF33感染時細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。1%和2%KFY使PBMC胞體顯著增大，以胞漿增多為主，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生，微絨毛增生，生長中后期細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)

7、多數(shù)空泡。先用HIV-1 SF33感染5天，再加受試物作用2天，觀察細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡和透射電鏡病理形態(tài)學(xué)變化，1%KFY使PBMC粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生、微絨毛增多，合胞體細(xì)胞形成、細(xì)胞間病毒顆粒及胞質(zhì)內(nèi)高電子密度顆粒的數(shù)量減少，并使細(xì)胞器病變程度減輕。
　　（二）分子水平研究
　　本研究從對與gp120受體蛋白及受體不同區(qū)域結(jié)合的影響、對HIV病毒DNA/RNA和逆轉(zhuǎn)錄酶的影響等分子水平探討了本品抗HIV病毒的機(jī)理。
　　為

8、了觀察藥物對MT4細(xì)胞與HIV-1 gp120結(jié)合能力的影響，將MT4細(xì)胞與受試物混合培養(yǎng)1小時后洗去藥物，再加入HIV-1 gp120，測定各組細(xì)胞結(jié)合HIV-1 gp120的量，結(jié)果表明KFY對MT4細(xì)胞與gp120蛋白結(jié)合的IC50為1.34%。進(jìn)一步考察KFY對HIV-1 gp120不同位點(diǎn)與其抗體結(jié)合的影響，結(jié)果表明，KFY對HIV-1 gp120蛋白的V3區(qū)的影響比較大，對HIV-1 gp120與CD4的結(jié)合位點(diǎn)也有影響，對

9、V1/V2區(qū)的影響較小。
　　用Real time PCR/RT-PCR測定細(xì)胞內(nèi)HIV DNA和HIV RNA相對含量的△Ct值，1%KFY對HIV DNA和RNA有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率達(dá)88%~99%。
　　用ELISA法測定供試品對感染MT-4細(xì)胞中HIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性的影響,結(jié)果表明，KFY對HIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性抑制作用較弱，治療指數(shù)平均為4.15±0.31。
　　綜上所述，本研究以MT4細(xì)胞株、臨床分離

10、PBMC細(xì)胞及動物為研究對象，用MTT法、酶聯(lián)免疫法、血球計(jì)數(shù)儀、3H摻入法液閃儀測定、流式細(xì)胞儀、放射免疫法、光鏡電鏡觀察、Real time PCR/RT-PCR等手段，從細(xì)胞水平、ex vivo、在體動物水平研究了KFY的抗HIV-1病毒作用及免疫調(diào)節(jié)作用，從細(xì)胞水平及gp120受體、病毒DNA/RNA和逆轉(zhuǎn)錄酶等分子水平探索了本品的抗病毒的機(jī)理。
　　本研究的主要研究結(jié)果及意義如下：
　　本品具有保護(hù)T細(xì)胞免受HIV

11、感染、抑制HIV復(fù)制以及保護(hù)白細(xì)胞下降、促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能等作用，可以作為一種應(yīng)用于治療艾滋病的藥物進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)研究，本研究為下一步進(jìn)行臨床研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。
　　本研究所用的抗 HIV研究模型，包括體外兩種細(xì)胞兩種加藥方式的抗HIV病毒模型、ex vivo抗病毒模型、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)動物模型、細(xì)胞學(xué)機(jī)制研究以及受體、遺傳物質(zhì)、逆轉(zhuǎn)錄酶等分子水平的機(jī)制研究，為今后天然藥物抗HIV研究提供了參考和研究平臺。
　　

12、本研究首次應(yīng)用中效原理法評價(jià)多組分之間的抗HIV作用關(guān)系，既有兩種藥物的聯(lián)合作用，又有四種藥物的聯(lián)合作用，既有拮抗作用，又有協(xié)同作用，為類似的多組分或多藥聯(lián)合作用的研究提供了思路。
　　本研究首次將HIV gp120不同位點(diǎn)抗體應(yīng)用于機(jī)理研究中，發(fā)現(xiàn)本品能夠抑制宿主細(xì)胞與HIV gp120的V3區(qū)域結(jié)合，對HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制作用較弱，揭示了本品的作用機(jī)理提示今后在臨床研究中本品可以與逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑聯(lián)用，以減少交叉耐藥性，增強(qiáng)抗病毒