玻璃化冷凍對臍血造血干-祖細胞活率與生物學特征的影響及導入平衡時間的設計.pdf

1、臍血是造血干/祖細胞的一個重要來源，可用于臨床移植來恢復患者的髓系造血功能。臍血采集后至進入臨床應用前，需要優(yōu)良的冷凍技術來保持造血干細胞的活性與特征。目前，除了傳統(tǒng)的慢速凍存法外，玻璃化法逐漸成為一種頗具應用前景的低溫保存技術，而良好的干細胞低溫保存方案不僅要保證一定的細胞活率，同時要維持干細胞的增殖及分化能力。 本實驗室在前期的研究中篩選出聯(lián)合玻璃化保護劑配方，并對臍血來源的造血干/祖細胞進行了低溫保存。為了評價該玻璃化冷凍

2、方案的效果，本文首先用臺盼藍拒染法檢測凍后細胞活率，并用流式細胞術測定CD34+細胞的百分含量，再對凍后的細胞進行短期的靜態(tài)培養(yǎng)和長期的集落培養(yǎng)，綜合考查凍后細胞的回收率與生物學特征。其次，由于導入過程是細胞發(fā)生損傷的主要環(huán)節(jié)，繼而又對導入過程平衡時間進行了優(yōu)化設計。實驗方法主要采用顯微攝像系統(tǒng)拍攝細胞照片，對導入過程不同時刻的細胞體積進行統(tǒng)計分析，并結(jié)合細胞活率的測定，確定適宜的導入平衡時間。 結(jié)果表明：玻璃化冷凍復蘇后，單個

3、有核細胞平均回收率可達到81.5±1.7％，而傳統(tǒng)的慢速凍存法，單個有核細胞回收率僅為74.7±2.6％，兩者存在顯著性差異。慢速凍存組CD34+細胞的回收率為52.3％，略高于玻璃化凍存組49.7％，但兩者無顯著性差異。雖然，CD34+細胞的回收率無顯著差異。原代細胞，玻璃化凍后細胞和慢速冷凍后細胞在72小時內(nèi)的生長狀態(tài)良好，擴增倍數(shù)分別為2.7，2.3和1.9倍。各組細胞進行14天集落培養(yǎng)，均可形成典型的BFU-E，CFU-GM和C

4、FU-GEMM集落，各實驗組無顯著性差異，玻璃化凍存組的集落回收率可達到90％以上。 優(yōu)化前導入平衡時間為等時間間隔，即每步導入之間均為90s，總時間為450s。細胞的體積皺縮到初始體積的35％以下，并無法有效恢復。細胞活率為88.1±3.0％。優(yōu)化設計的平衡時間為前短后長的非等平衡時間間隔，即180s，180s，90s，90s和60s，總時間為600s。細胞的體積恢復至初始體積的63％，細胞活率為95.4±0.4％，具有顯著提