ABCG2基因?qū)δ膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)黃曲霉毒素M1的影響.pdf

1、黃曲霉毒素(AF)被劃定為I類致癌物，黃曲霉毒素B1(AFB1)是一種主要的黃曲霉毒素，其污染物大大降低了食物的安全水平，對人類的健康有重大的威脅。黃曲霉毒素M1(AFM1)是AFB1的二次毒性代謝產(chǎn)物，奶牛攝入被AFB1污染的飼料，15min后可在血液中檢測到AFM1，8h后可在奶中檢測到AFM1。部分AFM1會隨乳汁、尿液排出，一部分則留在動物的可食用的組織和器官如血、腎、肝等。AFM1在乳汁中最為常見，這使得牛奶及其奶制品成為易受

2、AFM1污染的食品。因此深入研究奶牛血乳屏障對AFM1攝取的機(jī)理，將有助于有效地減少奶牛乳腺上皮細(xì)胞對血液循環(huán)中AFM1的攝取，從而保證我國牛奶以及奶制品的質(zhì)量安全。
　　為了研究奶牛血乳屏障對AFM1的攝取方式以及轉(zhuǎn)運(yùn)AFM1的分子機(jī)理，本實驗采用中國荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，細(xì)胞以1×106個/mL的密度接種在Transwell小室的聚碳酸酯膜上，在體外構(gòu)建了奶牛血乳屏障模型。在體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障是由單一的乳腺上

3、皮細(xì)胞增殖而來。激光掃描共聚焦結(jié)果顯示，乳腺上皮細(xì)胞之間形成了較好的緊密連接，而且乳腺上皮細(xì)胞仍具有合成酪蛋白的功能。所以在體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障模型可以成為體外研究藥物在血乳屏障中轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的模型。
　　為了研究奶牛乳腺上皮細(xì)胞對AFM1的攝取方式，通過采用熒光定量PCR檢測了在培養(yǎng)體系中添加AFM1對體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障中ABCG2、ABCC5、ABCC1、ABCB1、ABCC3、5-HT、SLC22A5和SLC22A4基因m

4、RNA表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示在血乳屏障中ABCG2和ABCB1表達(dá)量較高，有可能參與AFM1在血乳屏障中的轉(zhuǎn)運(yùn)。同時，我們也采用Western blotting方法檢測了在培養(yǎng)體系中添加AFM1對ABCG2和ABCB1蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示與不添加AFM1培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞相比，ABCG2和ABCB1蛋白表達(dá)量顯著提高(P＜0.01)，這種結(jié)果更大程度上表明ABCG2和ABCB1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與AFM1轉(zhuǎn)運(yùn)的可能性。
　　為了

5、進(jìn)一步研究ABCG2對AFM1轉(zhuǎn)運(yùn)作用的影響，試驗構(gòu)建重組質(zhì)粒pGCMV-ABCG2-IRES-EGFP對細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，從而進(jìn)行ABCG2基因的過表達(dá)試驗研究;同時應(yīng)用RNA干擾的方法用ABCG2 siRNA對細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，從而進(jìn)行ABCG2基因的抑制試驗研究。再通過采用熒光定量PCR和Western blotting檢測在培養(yǎng)體系中添加AFM1對體外構(gòu)建的奶牛血乳屏障中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2 mRNA和蛋白表達(dá)量的影響，同時采用液

6、相色譜法對收集的細(xì)胞和Transwell上室的培養(yǎng)液中AFM1的含量進(jìn)行檢測。熒光定量PCR和Western blotting結(jié)果顯示:ABCG2基因的過表達(dá)和抑制對ABCG2 mRNA和蛋白表達(dá)量均有極顯著性影響(P＜0.01)，而對β-酪蛋白的表達(dá)均無顯著性影響（P＞0.05）。AFM1液相色譜結(jié)果顯示:ABCG2基因過表達(dá)上調(diào)細(xì)胞以及上室培養(yǎng)液中AFM1的含量(P＜0.01)，ABCG2基因抑制下調(diào)細(xì)胞以及上室培養(yǎng)液中AFM1的含