兩個神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病家系致病基因的分子遺傳學(xué)研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病是由于生殖細(xì)胞或受精卵遺傳物質(zhì)的數(shù)量、結(jié)構(gòu)或功能改變，使發(fā)育的個體出現(xiàn)以神經(jīng)功能缺損為主要臨床表現(xiàn)的疾病。神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病是人類所有遺傳性疾病中非常重要的一類，也是神經(jīng)系統(tǒng)疾病和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的重要組成部分，在所發(fā)現(xiàn)的遺傳性疾病中約占半數(shù)以上。神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病病種繁多，而且大都具有家族性和終身性的特點，但是不少疾病的病因和發(fā)病機制尚未闡明。有研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病可在任何年齡發(fā)病，但是大多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病的發(fā)病年齡在30歲之

2、前。目前大多數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病尚無有效的治療方法，致畸、致殘及致死率高，危害極大且預(yù)后不良，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。大多數(shù)遺傳病仍主要以預(yù)防為主，因此，做好遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷，預(yù)防患兒的出生就變得尤為重要。近年來，隨著人類基因組草圖的完成，神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病在致病基因定位、克隆、基因及基因產(chǎn)物診斷和治療等方面取得了突破，為神經(jīng)遺傳病的研究提供了更多方法和途徑。
　　 腓骨肌萎縮癥又稱Charcot-Marie-Tooth病(CMT)，

3、也被叫做遺傳性運動感覺周圍神經(jīng)病，是一組遺傳異質(zhì)性極強的周圍神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病。該組疾病是遺傳性周圍神經(jīng)病最常見的類型，發(fā)病率為1/2500。腓骨肌萎縮癥屬于累及神經(jīng)軸索和髓鞘的神經(jīng)遺傳病，病理改變以神經(jīng)軸索的脫髓鞘和變性為主。遺傳性痙攣性截癱(Hereditaryspasticparaplegias，HSPs)是一組具有明顯臨床及遺傳異質(zhì)性的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病，臨床上以進(jìn)行性的雙下肢肌張力增高、肌無力和剪刀步態(tài)為主要特征，發(fā)病率為2-10/1

4、0萬。遺傳性痙攣性截癱與腓骨肌萎縮癥類似，兩者同屬于累及神經(jīng)軸索的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病。其病理改變以上運動神經(jīng)元的軸索變性和脫髓鞘為主，主要累及脊髓內(nèi)長的上、下行纖維束（皮質(zhì)脊髓束及背束），尤其是纖維束的遠(yuǎn)端。二者的區(qū)別在于遺傳性痙攣性截癱主要累及的是上運動神經(jīng)元的軸索，而腓骨肌萎縮癥主要累及下運動神經(jīng)元的軸索，同時感覺神經(jīng)也不同程度地受累。遺傳性痙攣性截癱和腓骨肌萎縮癥在發(fā)病機制上存在著交叉重疊，因此，研究這兩種疾病的發(fā)病機制對于理解神經(jīng)軸

5、索正常功能的維持具有極其重要的意義。
　　 在本研究中，我們利用在山東采集到的兩個家系，對上述兩種神經(jīng)遺傳病進(jìn)行了分子遺傳學(xué)的研究，檢測了相關(guān)的致病基因并鑒定了突變類型。相關(guān)致病基因的鑒定和分離，為揭示上述疾病的發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。同時，還為兩家系下一步的遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供了保障，從而在一定程度上預(yù)防患兒出生，達(dá)到提高人口素質(zhì)的目的。
　　 第一部分—X連鎖腓骨肌萎縮癥家系致病基因的突變分析
　　 腓骨肌萎縮

6、癥(Charcot-Marie-Toothdisease，CMT)也被叫做遺傳性運動感覺周圍神經(jīng)病(Hereditarymotorandsensoryneuropathies，HMSN)，是一組遺傳異質(zhì)性極高的周圍神經(jīng)系統(tǒng)受累的神經(jīng)遺傳病，其臨床表現(xiàn)呈緩慢進(jìn)展地上、下肢遠(yuǎn)端肌肉的進(jìn)行性肌無力和萎縮，尤以雙下肢遠(yuǎn)端的肌肉受累較重;足部肌肉萎縮可見爪形足、內(nèi)翻馬蹄足、垂足等畸形;病情嚴(yán)重者可見小腿和大腿下1/3肌萎縮而呈現(xiàn)典型的“鶴腿”樣或

7、倒立的香檳酒瓶狀畸形，伴有肢體遠(yuǎn)端不同程度的感覺障礙和腱反射減弱或消失，少數(shù)患者出現(xiàn)可逆性或持久性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累。該病的發(fā)病率為1/2500，遺傳方式可為常染色體顯性遺傳(AD)、常染色體隱性遺傳(AR)、X連鎖顯性遺傳(XD)或X連鎖隱性遺傳(XR)?；颊甙l(fā)病較早，大多數(shù)患者在20歲以前發(fā)病。根據(jù)腓骨肌萎縮癥的病理和電生理特點，將其分為兩型:Ⅰ型（脫髓鞘型）和Ⅱ型（軸索型）。Ⅰ型（脫髓鞘型），即CMT1，病理改變以周圍神經(jīng)脫髓鞘為

8、主，表現(xiàn)為節(jié)段性脫髓鞘和髓鞘再生、施旺細(xì)胞增生形成“洋蔥球”樣改變;神經(jīng)傳導(dǎo)速度下降明顯，正中神經(jīng)運動傳導(dǎo)速度(medianmotornerveconductionvelocity，MNCV)＜38米/秒(m/s);Ⅱ型（軸索型），即CMT2，病理改變以周圍神經(jīng)軸索變性為主;神經(jīng)傳導(dǎo)速度正?；蛘呓咏！?8m/s。另有研究表明，部分CMT家系患者的MNCV在25-45m/s之間，稱之為中間型CMT(CMTDI)。
　　 CMT

9、lA是常染色體顯性遺傳的Charcot-Marie-Tooth病最為常見的類型，占CMT患者的40％-50％，PMP22是其致病基因。PMP22基因編碼一種髓鞘蛋白，該基因的重復(fù)突變是導(dǎo)致CMTlA最常見、最主要的致病原因，此外少數(shù)為點突變。X連鎖的Charcot-Marie-Tooth病(CMTX)在CMT患者中占到了10％-20％;其中，90％以上的CMTX，即CMTX1型，是由GJB1基因突變所致的。GJB1基因位于Xq13.1，

10、編碼一種32KD的間隙連接蛋白CONNEXIN32，組成間隙連接通道介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間的離子、小分子營養(yǎng)物質(zhì)交換及信號分子傳遞，該蛋白在周圍神經(jīng)的施旺細(xì)胞和中樞神經(jīng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。
　　 我們在山東省發(fā)現(xiàn)了一個含有5代的CMT家系，家系中共有12名成員有癥狀且均為男性，該家系無男傳男現(xiàn)象，女性攜帶者沒有癥狀，初步考慮該家系患者為CMTX型。我們對該家系進(jìn)行了臨床分析、相關(guān)輔助檢查，并采集了14人的DNA樣本。隨后，我們利用

11、候選基因克隆的分析方法，首先對GJB1基因全部編碼序列進(jìn)行了擴增及sanger測序，發(fā)現(xiàn)該家系的突變基因為GJB1基因，該基因的c.614A＞G(p.Asn205Ser)突變國外已有報道但國內(nèi)尚未見報道。該錯義突變使堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換(c.614A＞G)并導(dǎo)致第205位的氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸。生物信息學(xué)分析提示該突變造成了CX32蛋白功能異常。該突變的發(fā)現(xiàn)，使給該家系提供遺傳咨詢與產(chǎn)前診斷服務(wù)成為可能。
　　 第二部分—常染色體

12、顯性遺傳性痙攣性截癱家系致病基因的鑒定
　　 我們在山東威海地區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個遺傳性痙攣性截癱的大家系。該家系共有四代，其中包括4名患者。家系中的患者具有遺傳性痙攣性截癱的典型癥狀，發(fā)病年齡均為45歲左右。該家系中男女均有發(fā)病，女性患者多于男性。家系中連續(xù)幾代均有發(fā)病患者，且存在無癥狀攜帶者。通過系譜分析，我們考慮該遺傳性痙攣性截癱家系的遺傳方式為最常見的常染色體顯性遺傳。
　　 經(jīng)詳細(xì)的臨床調(diào)查，該遺傳性痙攣性截癱家系的臨

13、床特點總結(jié)如下:①患者均發(fā)病較晚（45歲左右）;②病情進(jìn)展緩慢;③臨床癥狀差異較大，同時家系中存在完全不表現(xiàn)癥狀的攜帶者（考慮可能是尚未達(dá)到發(fā)病年齡）;④無遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象;⑤主要表現(xiàn)為進(jìn)行性雙下肢肌張力增高、肌無力、步態(tài)不穩(wěn)和剪刀步態(tài);⑥頭部MRI、胸腰椎CT、肌電圖等檢查均未見明顯異常;根據(jù)遺傳性痙攣性截癱的診斷標(biāo)準(zhǔn)，可以確診該家系為單純型遺傳性痙攣性截癱。
　　 在取得該家系樣本后，我們首先采用連鎖分析的方法，對已知的最常見的

14、一個單純型常染色體顯性遺傳性痙攣性截癱的致病基因—SPASTIN(SPAST)基因進(jìn)行了分析。我們分別在該基因位點附近選擇緊密連鎖的2個微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點—D2S2351、D2S2347，這兩個位點分別位于基因的上游0.2Mb和下游0.9Mb，通過對微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點進(jìn)行基因分型和計算LODscore值，排除或確定該基因為家系的致病基因。該家系在D2S2351位點不存在多態(tài)性;D2S2347位點與SPASTIN基因表現(xiàn)出一定的連鎖關(guān)

15、系，所計算的LOD值為2.635，提示該基因與表型呈現(xiàn)一定程度的共分離。
　　 隨后我們利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction，PCR)及測序的方法對先證者進(jìn)行了SPAST基因的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)先證者在該基因的第15外顯子內(nèi)存在一個14bp的雜合缺失(c.1630-1643delTACTCAGGAAGTGA)，該位點的堿基缺失導(dǎo)致移碼突變引起終止密碼子的提前出現(xiàn)，從而導(dǎo)致翻譯提前終止(p.tyr544p

16、rofsX28)。隨后，我們對家系其他成員進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家系中所有已發(fā)病患者均攜帶該缺失突變，在家系中這一新突變與疾病表型共分離。另外我們還發(fā)現(xiàn)家系中的兩位年輕個體也攜帶該缺失突變但是并未表現(xiàn)出臨床癥狀。我們推測可能是由于尚未達(dá)到發(fā)病年齡因而沒有疾病表型。同時，我們也利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對家系中所有成員及50名正常對照的相應(yīng)位點進(jìn)行了分析，驗證了上述結(jié)果，也排除了該突變?yōu)橐欢鄳B(tài)位點的可能。我們又利用TA克隆技術(shù)進(jìn)一步準(zhǔn)

17、確分離并測序了含有該缺失突變的DNA片段，這也更有利的證實了以上的實驗結(jié)果。經(jīng)查詢?nèi)祟惢蛲蛔償?shù)據(jù)庫(HGMD)，證實該突變?yōu)橐恍峦蛔儭?br>　　 該缺失突變(c.1630-1643delTACTCAGGAAGTGA)導(dǎo)致SPASTIN蛋白的翻譯提前終止(p.tyr544profsX28)，因此，我們推測該家系的致病機制可能為單倍體劑量不足。
　　 綜上所述，本研究對兩個與神經(jīng)軸索變性和脫髓鞘相關(guān)的神經(jīng)遺傳病家系的致病基因進(jìn)

18、行了鑒定:GJB1基因的錯義突變c.614A＞G(p.Asn205Ser)是腓骨肌萎縮癥家系的致病突變，該突變國外已有報道但是國內(nèi)尚未見報道，為國內(nèi)報道的新突變;一個新的SPAST基因的缺失突變(c.1630-1643delTACTCAGGAAGTGA)導(dǎo)致HSP家系成員致病，該缺失導(dǎo)致移碼突變，引起終止密碼子的提前出現(xiàn)，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止(p.tyr544profsX28)，該突變國內(nèi)外均未見報道。這些研究結(jié)果擴充了疾病的突變譜，為