MicroRNA-134靶向Nanog基因調控膠質瘤細胞生物學活性.pdf

1、目的:研究不同級別膠質瘤組織以及膠質瘤細胞系中microRNA-134(miR-134)的表達,建立穩(wěn)定表達miR-134的膠質瘤細胞株,研究miR-134過表達對膠質瘤細胞中Nanog的靶向抑制作用,并探索miR-134過表達對膠質瘤細胞體內外生物學活性的影響。為后續(xù)進一步研究Nanog相關通路的膠質瘤基因靶向治療奠定基礎。
　　方法:①Real-timePCR方法檢測11例正常腦組織(取自顱腦損傷行內減壓術患者)、42例不同級

2、別腦膠質瘤組織、人腦膠質瘤細胞系U87、U251中miR-134的表達情況。②通過慢病毒包裝的miR-134表達載體轉染U87膠質瘤細胞,利用篩選抗生素(滅瘟素,BlasticidinS)持續(xù)篩選,建立穩(wěn)定表達miR-134的膠質瘤細胞株,并通過RT-PCR和Westernblotting實驗分別檢測該細胞株中Nanog的mRNA和蛋白表達水平。③通過MTT、Transwell細胞遷移侵襲實驗、細胞劃痕、流式細胞術、透射電鏡、裸鼠成瘤實

3、驗、免疫組織化學染色等方法檢測miR-134靶向抑制Nanog后對膠質瘤細胞體內外生物學活性的影響。
　　結果:①與正常腦組織相比,miR-134在不同級別膠質瘤中的表達均明顯下降(均P<0.05)。WHOⅢ~Ⅳ級膠質瘤組織中miR-134表達明顯低于WHOⅠ~Ⅱ級(P<0.05)。與正常腦組織相比,miR-134在膠質瘤細胞系U87、U251中的表達亦顯著降低(均P<0.05)。②通過使用殺稻瘟素(Bsd)持續(xù)篩選20天后,獲得

4、穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的細胞株,熒光顯微鏡下觀察傳代5次以上的轉染細胞株可見所有細胞均穩(wěn)定表達GFP熒光。Real-timePCR測得U87-miR-134組與空白對照組及空質粒組相比,miR-134水平顯著提高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),空質粒組和空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示成功建立了穩(wěn)轉細胞株U87-miR-134組和空質粒組。進一步研究顯示U87

5、-miR-134細胞中Nanog的mRNA和蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)。③與空白對照組及空質粒組相比,U87-miR-134膠質瘤細胞的增殖水平、侵襲和遷移能力均明顯下調,細胞凋亡顯著增加;U87-miR-134異位移植瘤的體積與質量都明顯小于空白對照組和空質粒組細胞形成的腫瘤,提示裸鼠皮下成瘤能力亦明顯下降(P<0.05)。
　　結論:①miR-134在膠質瘤中呈低表達。提示miR-134的表達下調可能與膠質瘤的發(fā)生發(fā)