MicroRNA-155在腎透明細胞癌中的表達以及對人腎癌細胞ACHN生物學性狀的影響.pdf

1、研究背景：腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是常見的泌尿系惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于膀胱癌，位居第二，其發(fā)病率占成人惡性腫瘤的2％～3％，其中腎透明細胞癌(clear renal cell carcinoma，ccRCC)占70％～80％左右。全世界腎癌發(fā)病率每年增加2％，每年死于腎癌者近100000例。腎癌早期無癥狀，約50％的患者首次就診時已經屬于晚期，進展期腎癌的5年生存率低于10％。在我國，近年來腎癌的發(fā)病率有

2、上升的趨勢，嚴重威脅者人民的生命健康安全，但是我們對腎癌的發(fā)病機制尚缺乏全面和深入的了解。和其他的腫瘤相比，腎癌惡性程度高，傳統的治療方法除外科手術外，化療、放療、免疫治療等并不能起到良好的治療效果。因此闡明發(fā)病機理、尋找新的治療手段仍然是泌尿外科的熱點課題。
　　 微小RNA(microRNA或miRNA)是一類近年來發(fā)現的長度為21～25個核苷酸的內源性非編碼小RNA分子，miRNA可通過與靶mRNA的3’非編碼區(qū)結合，可以

3、在轉錄后水平通過促進靶mRNA降解和/或抑制其翻譯而發(fā)揮負調控基因表達的作用。miRNAs廣泛地參與調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡，以及個體發(fā)育、機體代謝等過程。研究發(fā)現，miRNAs在不同的腫瘤組織中表達水平不同，有些表達水平明顯低于正常組織，有些則明顯的上調，這些表達異常的miRNAs可能與腫瘤的發(fā)生有著密切的關系，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著癌基因或抑癌基因的作用。目前認為，引起miRNA在腫瘤細胞中表達水平發(fā)生改變的可能原因有染色體重組

4、、基因擴增、突變及表觀遺傳學改變等。
　　 miR-155，定位于人染色體21q21，由BIC基因編碼。人類BIC基因含3個外顯子，其中第3個外顯子高度保守的區(qū)域編碼miR-155。miR-155是一個典型的多功能基因，由其下游基因介導，參與多種生理病理過程，如腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，炎癥和免疫，其在人類多種惡性腫瘤中高表達，如非小細胞肺癌，乳腺癌，胰腺癌等。研究表明在很多腫瘤中miR-155作為癌基因發(fā)揮功能。
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5、iR-155功能和表達的調節(jié)機制仍然不甚清楚，但是在多種腫瘤組織中的過表達讓我們意識到其在腫瘤診斷和治療中的巨大潛力。為了探索miR-155與腎透明細胞癌發(fā)生、發(fā)展的關系，我們用實時實時定量PCR技術檢測其在腎透明細胞癌及癌旁非腫瘤組織中的表達情況，研究其與臨床分期、病理分級之間的關系。同時檢測各腎癌細胞株中miR-155的表達情況，篩選合適的體外腎癌細胞模型，研究其對腎癌細胞的生物學行為的影響，如增殖能力，侵襲能力等。繼之用生物信息學

6、預測miR-155可能的靶基因，并進行了初步的實驗驗證，探討其在腎癌中可能的作用機制，為腎癌的早期診斷和治療提供新的思路。
　　 第一章 miR-155在人腎透明細胞癌中的表達情況及其與臨床分期、病理分級的關系研究。
　　 目的：探討miR-155在腎透明細胞癌中的表達及其意義。
　　 方法：用實時定量PCR技術檢測16例ccRCC及癌旁非腫瘤組織中miR-155的表達情況，研究其與ccRCC臨床分期、病理分級之

7、間的關系。
　　 結果：實時定量PCR結果發(fā)現，在16例ccRcc患者中，與配對的癌旁非腫瘤組織相比，腫瘤組織中miR-155的表達在94％(15例)的樣本中上調，僅在一例樣本中下調，其中ccRCC中miR-155的相對表達量為2.08～26.05，平均12.70±6.52，癌旁非腫瘤組織中相對表達量為1.00～6.79，平均2.82±1.25，改變有顯著統計學差異(P<0.05)。16例ccRCC標本中，根據病理分級樣分組，高

8、分化組miR-155的相對含量為11.43±6.18，中-低分化組為14.33±7.04，沒有顯著差異(P>0.05)。在不同臨床分期組合樣本中，Ⅰ期miR-155的相對含量為13.50±6.55，Ⅱ-Ⅲ期為10.93±6.79，沒有顯著差異(P>0.05)
　　 結論：
　　 1、ccRCC患者癌組織中的miR-155的表達水平較癌旁非腫瘤組織明顯上調，提示miR-155的表達上調可能與ccRCC的發(fā)病機制相關。

9、>　　 2、在ccRCC患者中，miR-155的表達的表達水平與ccRCC的病理分級及臨床分期組合無顯著相關性。
　　 目的：探討miR-155對腎癌細胞生物學性狀的影響，包括細胞增殖，細胞凋亡和細胞侵襲能力的影響。
　　 方法：檢測腎癌細胞株(ACHN和KC細胞)中及正常腎小管上皮細胞株(HK2)中miR-155的表達情況，結合細胞的增殖和分化特征，篩選合適的腎癌細胞株。使用LipofectamineTM2000轉染

10、hsa-mir-155 inhibitor于腎癌細胞株，敲低miR-155的表達，實時定量PCR檢測轉染后miR-155表達，MTT法、Annexin V/PI雙染法和Transwell侵襲實驗分別觀察細胞增殖、凋亡及侵襲能力的變化。
　　 結果：腎癌細胞株ACHN、KC細胞，正常腎小管上皮細胞株HK2的miR-155的相對表達量分別為9.3，3.0和1.0。選擇ACHN細胞株作為體外細胞模型。實驗分為正常細胞組，陰性對照組，m

11、iR-155抑制組3組。成功轉染ACHN胞，結果顯示抑制組中miR-155的相對含量為1.25±0.22，陰性對照組為7.03±0.18，有顯著性差異(P<0.05)。用MTT法檢測細胞的生長抑制率，流式細胞術檢測其凋亡率，細胞侵襲實驗檢測其侵襲能力，發(fā)現轉染48小時后，抑制組細胞的相對存活率66.6±1.0％，陰性對照組為97.1±1.5％，有顯著性差異(P<0.05)；抑制組ACHN胞的凋亡率為13.76±0.86％，而正常組和陰性

12、對照組的凋亡率分別為5.98±0.44％和7.16±1.07％，有顯著性差異(P<0.05)；Transwell侵襲實驗結果顯示侵襲細胞數正常組42.17±1.38，對照組41.22±1.65，抑制組14.74±1.06，抑制組相對于正常組和對照組有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1、hsa-mir-155 inhibitor能有效的轉染于ACHN細胞，降低ACHN細胞中miR-155的表達。
　

13、　 2、miR-155的低表達能使ACHN細胞增殖受到抑制，凋亡率增加，同時細胞的侵襲能力減弱。
　　 3、miR-155在腎癌中可能起著癌基因的作用，通過抑制其表達，有望達到治療腎癌的目的
　　 第三章 microrna-155影響腎癌細胞的機制探討。
　　 目的：探討miR-155影響ACHN腎癌細胞的分子學機制。
　　 方法：通過生物信息學方法(如miRanda，Pictar，Targetscan

14、)預測microrna-155的靶基因，用實時定量PCR及Western blot分別檢測對照組和抑制組中的miR-155的表達量及靶基因蛋白的表達，初步探討敲低microrna-155對抑制腎癌細胞生長的作用機制。
　　 結果：選擇TargetScan、PicTar和miRanda這3個軟件對miR-155進行靶基因預測，發(fā)現SOCS-1、BACH1和RAB34為miR-155可能潛在的靶基因。運用實時定量PCR技術，檢測轉染

15、后抑制組和陰性對照組中ACHN中miR-155的相對含量，以U6作為內參。結果顯示抑制組中miR-155的相對含量為1.25±0.22，陰性對照組為7.03±0.18，有顯著性差異(P<0.05)。Western blot顯示SOCS-1的蛋白表達比值(SOCS-1/GAPDH)在陰性對照組和抑制組中分別為0.053±0.015和0.047±0.006，無顯著性差異(P>0.05)。BACH1的蛋白表達比值(BACH1/GAPDH)分別

16、為0.125±0.005和0.376±0.015，有顯著性差異(P<0.05)。RAB34的蛋白表達比值(RAB34/GAPDH)分別為0.164±0.015和0.399±0.091有顯著性差異(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1、ACHN細胞中miR-155的表達與BACH1和RAB34蛋白表達呈負相關性，而與SOCS1蛋白表達無明顯關系。
　　 2、BACH1、RAB34可能為miR-155潛在的靶基因