使用熒光納米材料實(shí)時(shí)跟蹤技術(shù)可視化研究病毒與細(xì)胞相互作用.pdf

1、病毒與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用一直以來(lái)是病毒學(xué)界的研究熱點(diǎn)。例如在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的研究中，科研工作者通過(guò)建立HCV的細(xì)胞模型(亞基因組復(fù)制子模型和全長(zhǎng)基因組復(fù)制子模型)來(lái)研究細(xì)胞與病毒的相互作用，研究發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)十分重要的抗病毒藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)即NS3絲氨酸蛋白酶以及NS5BRNA依賴性RNA聚合酶。
　　 但所有類似的研究都需要基于一定的方法和策略。在SV40與Vero細(xì)胞的研究中使用諸如M

2、βCD、nocodazole等藥物并結(jié)合細(xì)胞器染色技術(shù)來(lái)研究病毒與細(xì)胞相互作用機(jī)理。而近年來(lái)使用化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記病毒衣殼蛋白或假病毒粒子(virus-like particles，VLPs)以研究病毒與細(xì)胞相互作用則是很有應(yīng)用前景的新方法。
　　 本研究基于我們實(shí)驗(yàn)室研究平臺(tái)并結(jié)合化學(xué)領(lǐng)域中新合成的發(fā)光納米材料(例如量子點(diǎn)，“光開(kāi)關(guān)”等)的優(yōu)勢(shì)，研究?jī)煞N無(wú)囊膜的病毒即兔出血熱病毒(rabbithemorrhagic diseas

3、e virus,RHDV)和人類博卡病毒(Human Bocavirus，HBoV)主要衣殼蛋白在昆蟲細(xì)胞中形成的VLPs與Sf9(Spodoptera frugiperda)、RK13(rabbit kidney13)以及豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)與豬精細(xì)胞(porcine testis，PT)的相互作用，進(jìn)而揭示病毒在細(xì)胞中的運(yùn)動(dòng)途徑，闡明病毒與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制，并根據(jù)這些數(shù)據(jù)來(lái)探索建立一個(gè)病毒

4、與細(xì)胞相互作用的一般研究方法。其完成的工作包括以下幾個(gè)方面：
　　 1.表達(dá)并純化出兔出血熱病毒RHDV衣殼蛋白VP60;
　　 1)將RHDV衣殼蛋白基因VP60插入到pMAL-c2X載體，獲得重組質(zhì)粒pMAL-VP60并在大腸桿菌DH5α中表達(dá)VP60蛋白，經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot檢測(cè)后，擴(kuò)大培養(yǎng)并利用Amylose親和層析柱純化VP60蛋白。并將純化出的VP60蛋白嘗試在體外控制條件下使其自組裝

5、成VLPs。
　　 2)使用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在High-Five cell(Hi-5)昆蟲細(xì)胞中表達(dá)VP60蛋白。重組Bacmid感染Sf9并使用MOI為5～10的病毒再感染Hi-5細(xì)胞以表達(dá)VP60-VLPs，然后使用蔗糖及CsCl梯度離心獲得較純凈的VLPs，電鏡觀察。
　　 2.表達(dá)并純化HBoV衣殼蛋白VP2;
　　 1)將HBoV衣殼蛋白基因VP2插入到PET-28(a)載體，獲得重