奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌毒力因子的克隆表達(dá)及生物活性研究.pdf

1、本實驗對奶牛乳腺炎陽性和陰性乳汁進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)計數(shù)和生化鑒定，對分離到的病原菌做藥物敏感性試驗。試驗中分離出的細(xì)菌主要是葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、棒狀桿菌和酵母菌。經(jīng)過生化鑒定，乳腺炎陽性乳分離得到的細(xì)菌大多數(shù)是明顯溶血的，凝固酶反應(yīng)呈陽性的強致病菌，細(xì)菌計數(shù)也高于乳腺炎陰性組，差異極顯著；而乳腺炎陰性乳中所分離得到的細(xì)菌大多是環(huán)境中條件性致病菌，致病性不強。 為建立奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌致病菌株的檢測方法，依據(jù)金黃色葡萄

2、球菌耐熱核酸酶Nuc基因序列，設(shè)計合成特異性引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增Nuc基因，并將擴增基因克隆入T載體，進(jìn)行序列測定，對所分離的奶牛乳腺炎病原菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：金黃色葡萄球菌擴增出特異性條帶，大小為694bp；其他菌株未出現(xiàn)條帶。敏感性檢測的最低濃度為1.25×10<'3>cfu/mL。 血漿凝固酶是檢驗致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)，它們能使含有抗凝劑的家兔或人的血漿凝固，有助于致病菌抵御宿主體內(nèi)吞噬細(xì)胞和殺菌物質(zhì)的

3、作用。依據(jù)金黃色葡萄球菌血漿凝固酶基因序列，設(shè)計合成特異性引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增其基因，并將擴增基因克隆入T載體，進(jìn)行序列測定，對所分離的奶牛乳腺炎病原菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示：金黃色葡萄球菌擴增出特異性條帶，大小為761bp；其他菌株未出現(xiàn)條帶。 金黃色葡萄球菌溶血素是一種外毒素，是其主要毒力因子之一，包括α、β、γ和6毒素。溶血素對多種哺乳動物紅細(xì)胞有溶血作用，并可作用于平滑肌細(xì)胞，引起乳腺平滑肌收縮、麻痹，引發(fā)牛的壞疽性

4、乳腺炎。本試驗設(shè)計雙重PCR方法，檢測山東省內(nèi)20多個規(guī)?；膛鋈橄傺撞±蟹蛛x得到的金黃色葡萄球菌，試驗發(fā)現(xiàn)：80％以上的金葡菌存在Q溶血素基因，基因片斷長～704bp；而β溶血素基因比例為59％，片斷大小為496bp。 檢測金黃色葡萄球菌粘附素基因Fnbp A和Fnbp B，分析奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌臨床分離株纖連蛋白連接蛋白主效基因。利用設(shè)計合成的特異性引物對金黃色葡萄球菌進(jìn)行PCR擴增，對本實驗室所分離鑒定的金葡菌臨

5、床分離株進(jìn)行雙重PCR檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳成像顯示，分別在524bp和642bp處出現(xiàn)特異性條帶。通過對會葡菌臨床分離株雙重PCR檢測發(fā)現(xiàn)：95％以上的金葡菌存在粘附素基因Fnbp A，而Fnbp B基因僅有10％。 檢測金黃色葡萄球菌粘附素基因clfA和clf B，分析奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌臨床分離株聚集因子主效基因。利用設(shè)計合成的特異性引物對金黃色葡萄球菌進(jìn)行PCR擴增，然后對本實驗室所分離鑒定的金葡菌臨床分離株進(jìn)行雙

6、重PCR檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳成像顯示，分別在292bp和205bp處出現(xiàn)特異性條帶。通過對金葡菌臨床分離株雙重PCR檢測發(fā)現(xiàn)：90％以上的金葡菌存在粘附素基因clfA，而clfB基因僅有40％。為克隆和表達(dá)奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌Fnbp A功能基因，采集奶牛急性乳腺炎乳樣，分離金黃色葡萄球菌，提取DNA作為模板，利用設(shè)計合成的特異性引物，對金黃色葡萄球菌進(jìn)行Fnbp A功能基因的PCR擴增。將目的基因回收并連接到T載體，鑒定后進(jìn)行

7、了測序，然后將Fnbp A基因連接到pET-32a(+)質(zhì)粒中，經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)后采用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳成像，僅金黃色葡萄球菌在1.7kb處出現(xiàn)特異性條帶，測序發(fā)現(xiàn)其與GenBank公布的Fnbp A序列的同源性為98％；蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在80ku處出現(xiàn)特異性條帶。本試驗成功地克隆到Fnbp A基因，并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，蛋白量為33.4

8、％。細(xì)菌粘附阻止試驗發(fā)現(xiàn)，蛋白可阻止73.24％的金黃色葡萄球菌粘附到哺乳動物細(xì)胞。試驗中發(fā)現(xiàn)一種急性毒素性壞疽奶牛乳腺炎，懷疑α-HL是其致病因素，采集奶牛急性乳腺炎乳樣，分離金黃色葡萄球菌，提取DNA作為模板，利用設(shè)計合成的特異性引物，對金黃色葡萄球菌進(jìn)行α-HL基因的PCR擴增。將目的基因回收并連接到T載體，鑒定后進(jìn)行了測序，然后將α-HL基因連接到pET-32a.(+)質(zhì)粒中，經(jīng)鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，工PTG誘導(dǎo)

9、后采用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳成像，僅金黃色葡萄球菌在893bp處出現(xiàn)特異性條帶，測序發(fā)現(xiàn)其與GenBank公布的α-HL序列的同源性為100％：蛋白誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在53ktj處出現(xiàn)特異性條帶，蛋白量為34％。重組蛋白活性檢測發(fā)現(xiàn)：蛋白可引起注射部位明顯溶血和壞死，兔紅細(xì)胞溶血試驗表明其溶血效價可達(dá)到2.26×10<'4>HU/mg。 根據(jù)金黃色葡萄球菌clfA基因，設(shè)計合成特異

10、性引物，以國內(nèi)奶牛乳腺炎臨床分離株金黃色葡萄球菌基因組為PCR模板，進(jìn)行clfA基因的克隆，并連接入pMD18-T載體進(jìn)行測序和序列分析，然后經(jīng)BamH I和Xba I雙酶切后構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-ClfA，并進(jìn)行鑒定。以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株為對照，國內(nèi)分離株多數(shù)在990bp處擴增到特異性條帶，經(jīng)測序鑒定，與GerlBailk發(fā)表的會葡菌clfA序列同源性為99％：構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒通過PCR和雙酶切鑒定證明構(gòu)建成功，為研究

11、核酸疫苗奠定基礎(chǔ)。 金黃色葡萄球菌Fnbp的抗體不僅可以阻止細(xì)菌的黏附，而且還是一種調(diào)理素，可以促進(jìn)機體對細(xì)菌的清除作用。金黃色葡萄球菌的α-溶血素是一種胞外毒素，其類毒素對金黃色葡萄球菌所致的羊乳腺炎有部分保護(hù)作用。本試驗利用獲得的基因工程蛋白rFnbp、rα-HL及真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1<'+>-ClfA，混合佐劑免疫試驗小鼠，通過ELISA方法檢測血清中的抗體水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：所有蛋白疫苗免疫試驗小白鼠在首免后所采集的