堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在腰椎肥厚黃韌帶中的表達(dá)及作用研究.pdf

1、目的：
　　 對(duì)纖維化相關(guān)細(xì)胞因子堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)mRNA及其蛋白表達(dá)量在肥厚與非肥厚腰椎黃韌帶中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討其在腰椎黃韌帶肥厚過(guò)程中的作用，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行黃韌帶細(xì)胞培養(yǎng)，加入相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)干預(yù)后膠原蛋白的mRNA及產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)組織實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行印證并探索黃韌帶肥厚的機(jī)制。
　　 背景：
　　 腰椎管狹窄

2、癥的主要病理改變之一是黃韌帶肥厚，但其病理機(jī)制還不是很清楚，在力學(xué)上，可能是因?yàn)樽甸g盤退變后的不穩(wěn)造成。目前的研究認(rèn)為黃韌帶肥厚可能是由于椎間不穩(wěn)使黃韌帶受牽拉，出現(xiàn)不斷的微損傷后持續(xù)的纖維化介導(dǎo)的疤痕組織積聚的結(jié)果。但黃韌帶肥厚的相關(guān)分子機(jī)制并不清楚，這也是臨床上對(duì)于腰椎黃韌帶肥厚所引起的腰椎管狹窄患者缺少藥物等保守治療手段的原因。有研究發(fā)現(xiàn)，腰椎黃韌帶細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后牽拉后TGF-β1分泌增加，而TGF-β1是公認(rèn)最強(qiáng)的促纖維化的細(xì)胞

3、因子。TGF-β1可能通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)的平衡而促進(jìn)其纖維化增生；然而也有研究發(fā)現(xiàn)，隨著黃韌帶肥厚程度增加，TGF-β表達(dá)反而減少，皮膚瘢痕的研究中也發(fā)現(xiàn)TGF-β只在疤痕形成早期表達(dá)，在肥厚的疤痕愈合后TGF-β表達(dá)明顯減少或停止表達(dá)，因此考慮TGF-β可能在黃韌帶肥厚形成早期發(fā)揮作用，介導(dǎo)膠原纖維的合成增加，而在黃韌帶持續(xù)纖維化中，則可能還有其他的促膠原纖維合成的生長(zhǎng)因子或細(xì)胞因子

4、參與。炎癥相關(guān)因子如COX-2、IL-1β、TNF-α、IL-1α、IL-8、IL-6等也可能參與調(diào)節(jié)纖維化過(guò)程。在皮膚瘢痕形成研究中發(fā)現(xiàn)，單一應(yīng)用任何的細(xì)胞生長(zhǎng)因子都不能使成纖維細(xì)胞持續(xù)的纖維化，多個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)因子共同作用是持續(xù)纖維化所必須的，TGF-β可能在介導(dǎo)纖維組織和肉芽組織形成中起作用，而bFGF和CTGF對(duì)維持細(xì)胞纖維化起重要作用，雖然bFBF、CTGF和TGF-β1在皮膚瘢痕愈合中的作用有了深入的研究，但在黃韌帶中的作用還未

5、見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。黃韌帶肥厚與皮膚瘢痕形成的關(guān)鍵細(xì)胞都是成纖維細(xì)胞，所以本研究認(rèn)為，在黃韌帶纖維化肥厚的過(guò)程中，bFBF、TGF-β1和CTGF可能有相似的作用。
　　 方法：
　　 本研究分為兩個(gè)部分：組織實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。組織實(shí)驗(yàn)分三個(gè)組：對(duì)照組6例、腰椎黃韌帶肥厚組6例、突出組(單純腰椎間盤突出癥患者)6例，分別作為正常黃韌帶、黃韌帶肥厚晚期和早期。對(duì)各組黃韌帶中bFGF、TGF-β1、CTGF及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ的mRN

6、A含量用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)，用Western Blot法檢測(cè)bFGF、TGF-β1、CTGF產(chǎn)物在各組黃韌帶中的表達(dá)，對(duì)三個(gè)細(xì)胞因子在黃韌帶肥厚過(guò)程中的作用進(jìn)行探討。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用年輕患者非肥厚的黃韌帶進(jìn)行培養(yǎng)，分成三個(gè)大組加入不同濃度的bFGF、TGF-β1，培養(yǎng)24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ的mRNA含量，用培養(yǎng)液以Elisa法檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ產(chǎn)物的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 腰椎黃韌帶組

7、織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，bFGF mRNA在腰椎管狹窄癥組中的表達(dá)均明顯高于突出組和對(duì)照組(P<0.05，P<0.05)，在突出組中的表達(dá)稍低于對(duì)照組，但兩組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CTGF mRNA在腰椎管狹窄癥組中的表達(dá)均值雖稍高，但三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；TGF-β1 mRNA在三組中的表達(dá)與bFGF相似，在狹窄組中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，也高于突出組(P<0.01)，在突出組和對(duì)照組之間沒(méi)有差異(P

8、>0.05)。Western blot檢測(cè)三者產(chǎn)物在黃韌帶中的表達(dá)也發(fā)現(xiàn)β-actin顯影良好，bFGF、TGF-β1在腰椎管狹窄組中均有明顯表達(dá)，且多于對(duì)照組。多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均未獲得CTGF的顯影條帶；COLⅠmRNA在腰椎管狹窄癥組中的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組和突出組(P<0.05，P<0.05)，在突出組中的表達(dá)稍高于對(duì)照組，但兩組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；COLⅢ、ⅤmRNA在三組中的表達(dá)均值雖有變化，但三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

9、(P>0.05)。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入TGF-β1時(shí)，COLⅠmRNA表達(dá)量隨濃度的增加而增加；加入bFGF時(shí)，COLⅠmRNA表達(dá)量隨濃度的增加而降低，但加入最低濃度時(shí)較對(duì)照組明顯表達(dá)增加，說(shuō)明黃韌帶細(xì)胞在bGFG低濃度時(shí)表達(dá)是增加的，而稍高濃度后則抑制COLⅠmRNA的表達(dá)；同時(shí)加入bFGF、TGF-β1時(shí)，COLⅠmRNA的表達(dá)仍基本是個(gè)增加的趨勢(shì)，在最高濃度時(shí)表達(dá)最高，說(shuō)明TGF-β1對(duì)COLⅠmRNA的影響占主導(dǎo)作用。統(tǒng)計(jì)結(jié)果

10、發(fā)現(xiàn)：
　　 1)TGF-β1、bFGF對(duì)COLⅠmRNA表達(dá)有顯著意義(p<0.01)；
　　 2)兩個(gè)因素有交互作用；
　　 3)兩個(gè)因素中TGF-β1占主要作用。
　　 加入TGF-β1時(shí)，COLⅢ mRNA在低濃度是隨濃度而增加，在TGF-β1濃度為1ng/ml時(shí)表達(dá)最多，增加濃度則表達(dá)量反而下降；加入bFGF時(shí)，COLⅢ mRNA的表達(dá)在低濃度是隨濃度而增加，10ng/ml時(shí)表達(dá)最高，而后增加b

11、FGF濃度則表達(dá)量逐漸下降；同時(shí)加入bFGF、TGF-β1時(shí)，COLⅢ mRNA的表達(dá)在bFGF為10ng/ml、TGF-β1為0.1ng/ml時(shí)表達(dá)最高，降低或升高濃度則表達(dá)下降，說(shuō)明bFGF對(duì)COLⅢ mRNA的作用占主導(dǎo)因素。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 1)TGFb1、bFGF對(duì)ColAⅢ mRNA表達(dá)有顯著意義(p<0.01)；
　　 2)兩個(gè)因素沒(méi)有有交互作用；
　　 3)兩個(gè)因素中bFGF占主要作用。

12、>　　 細(xì)胞培養(yǎng)液檢測(cè)各型膠原蛋白產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)：加入TGF-β1時(shí)，COLⅠ表達(dá)量先降低，而后隨濃度的增加而增加，當(dāng)TGF-β1濃度為1ng/ml時(shí)表達(dá)最高，說(shuō)明該細(xì)胞因子對(duì)COLⅠ的表達(dá)有明顯的影響；加入bFGF時(shí)，COLⅠ表達(dá)量隨濃度的增加基本是個(gè)增加的趨勢(shì)，但高濃度時(shí)變化不大，說(shuō)明黃韌帶細(xì)胞在高濃度下COLⅠ表達(dá)有影響，但在低濃度是影響明顯；同時(shí)加入bFGF、TGF-β1時(shí)，COLⅠ的表達(dá)先升高，而后維持相同的水平。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：<

13、br>　　 1)bFGF、bFGF對(duì)COLⅠ表達(dá)有顯著意義，(p<0.01)；
　　 2)兩個(gè)因素沒(méi)有交互作用；
　　 3)兩個(gè)因素中bFGF占主要作用。
　　 加入TGF-β1時(shí)，COLⅢ在低濃度是隨濃度而增加，在TGF-β1濃度為0.1ng/ml時(shí)表達(dá)最多，增加濃度則表達(dá)量反而下降；加入bFGF時(shí)，COLⅢ的表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有明顯區(qū)別；同時(shí)加入bFGF、TGF-β1時(shí)，COLⅢ mRNA的表達(dá)在bFGF為10

14、ng/ml、TGF-β1為0.1ng/ml時(shí)表達(dá)最高，降低或升高濃度則表達(dá)下降。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 1)TGF-β1對(duì)COLⅢ有顯著意義(p<0.01)，bFGF對(duì)COLⅢ無(wú)顯著意義(p>0.05)；
　　 2)兩個(gè)因素沒(méi)有交互作用。
　　 分別加入TGF-β1、bFGF或同時(shí)加入bFGF、TGF-β1時(shí)，COLⅤ的表達(dá)均沒(méi)有明顯的變化，各組間沒(méi)有差異。統(tǒng)計(jì)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：TGFb1、bFGF對(duì)COLⅤ無(wú)顯著意義(

15、p>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、本研究第一部分組織實(shí)驗(yàn)利用定量PCR方法檢測(cè)各組黃韌帶中bFGF、CTGF、TGF-β1 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)bFGF、TGF-β1 mRNA在黃韌帶肥厚組中表達(dá)明顯高于突出組和對(duì)照組，且Westren blot法檢測(cè)三細(xì)胞因子產(chǎn)物的表達(dá)也發(fā)現(xiàn)二者在肥厚的黃韌帶中表達(dá)增高，說(shuō)明bFGF、TGF-β1在腰椎黃韌帶肥厚形成過(guò)程中有重要作用；定量PCR法檢測(cè)COLⅠ、Ⅲ、Ⅴ mRNA發(fā)

16、現(xiàn)前二者在肥厚黃韌帶中表達(dá)明顯增高，但COLⅤ mRNA在三組中的表達(dá)沒(méi)有差異，表明引起黃韌帶肥厚的主要膠原產(chǎn)物為COLⅠ、Ⅲ。
　　 2、第二部分細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，分別加入不同濃度的bFGF、或二者同時(shí)加入時(shí)，表達(dá)有明顯增高或降低，加入TGF-β1時(shí)表達(dá)隨濃度增高而增高，加入bFGF時(shí)COLⅠmRNA表達(dá)在低濃度是增高，而后隨濃度增高表達(dá)降低，二因子對(duì)COLⅠmRNA的表達(dá)有交互作用且以TGF-β1為主；加入TGF-β1時(shí)COL

17、Ⅲ mRNA表達(dá)隨濃度增高而有增高趨勢(shì)，但不明顯，加入bFGF時(shí)COLⅢ mRNA表達(dá)先逐漸增高，而后隨濃度增高表達(dá)降低，二因子對(duì)COLⅢ mRNA的表達(dá)沒(méi)有交互作用，以bFGF對(duì)COLⅢ mRNA的影響為主；而COLⅤmRNA在各組細(xì)胞中沒(méi)有明顯表達(dá)。Elisa法檢測(cè)細(xì)胞液中COLⅠ、Ⅲ、Ⅴ三者產(chǎn)物的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，二因子對(duì)COLⅠ、Ⅲ的表達(dá)均有影響，但前者以bFGF影響為主，而后者以TGF-β1影響為主，COLⅤ在各組細(xì)胞中均有表達(dá)，但與