人類新發(fā)MERS冠狀病毒木瓜樣蛋白酶結構與生物學功能研究.pdf

1、背景:2012年6月,在一位沙特阿拉伯人身上首次發(fā)現(xiàn)一種類似于急性嚴重呼吸綜合征冠狀病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS-CoV)的病毒,隨即其便證明并命名為中東呼吸道綜合征冠狀病毒(Middle East Resperatory syndrome,MERS-CoV)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,截止2014年2月28日,MERS-CoV已感染184例,其中80例死亡,死亡率近45％。MERS-Co

2、V基因組由正義、單鏈RNA組成,且其編碼的兩個大復制酶多聚蛋白pp1a和pp1ab主要是由基因組前2/3部分翻譯得到。pp1a和pp1ab被木瓜樣蛋白酶(Papain-like protease,PLpro)和3C樣蛋白酶(Chymotrypsin-like protease,3CLpro)切割成16個非結構蛋白(nsp1-16)。Nsp1-16經(jīng)過組裝產(chǎn)生一個多功能、膜結合且可以介導完成病毒基因組復制和結構基因轉錄與翻譯的復制酶聚合體

3、(Replicase complex,RC)。區(qū)別于已知大多數(shù)編碼兩個木瓜樣蛋白酶(PLP1和PLP2)的冠狀病毒是,MERS-CoV僅編碼一個木瓜樣蛋白酶,PLpro。MERS nsp3編碼7個小的功能結構域,其中以PLpro為核心,且PLpro C端TM跨膜結構域將其定位于膜上。MERS-CoV感染出現(xiàn)后,其便成為醫(yī)學界研究的焦點和生物學界研究熱點之一,本實驗室率先針對MERS-CoV蛋白酶的結構學特征和生物學功能展開深入研究。

4、r>　　目的:以人類MERS-CoV帶跨膜結構域的木瓜樣蛋白酶PLpro-TM為研究對象,MERS PLpro高級結構、具體生物學功能以及其對宿主細胞內(nèi)IFN表達調(diào)控的研究,為進一步探究人類新冠狀病毒 MERS的致病機理提供理論依據(jù)和新抗病毒藥物的研發(fā)提供靶點。
　　方法:首先,人工合成MERS-CoV PLpro-TM和各個酶切底物nsp1-2,nsp2-3和nsp3-4。其次,利用PCR技術克隆得到不含跨膜結構域的MERS P

5、Lpro,并利用PCR定點突變試劑盒將PLpro-TM/PLpro蛋白酶催化活性中心Cys-His-Asp分別突變?yōu)?Ala,從而構建出三種酶活性缺失突變體;同時構建出各個蛋白酶酶切底物的LXGGA相應突變體。最后,利用蛋白印跡法、雙熒光素酶報告基因和免疫熒光染色技術檢測MERS PLpro-TM的生物學功能及其對宿主細胞內(nèi)IFN表達調(diào)控。對其機制進行進一步研究,首先利用 Western blot技術檢測 MERS-CoV PLpro-

6、TM對不同蛋白酶底物的切割情況,并利用 PCR定點突變技術構建PLpro-TM/PLpro酶活性突變體及蛋白酶底物點突變體,利用Western blotting技術檢測突變體對 PLpro-TM酶活性影響及突變體對蛋白酶底物切割的影響。其次,雙熒光素報告基因檢測 MERS PLpro-TM/PLpro及其蛋白酶催化活性突變體對宿主細胞內(nèi)IFN表達調(diào)控;Western blotting檢測MERS PLpro-TM對細胞內(nèi)IRF3磷酸化水

7、平影響;間接免疫熒光技術檢測MERS PLpro-TM對細胞內(nèi)IRF3入核活化的影響情況。最后Western blotting檢測MERS PLpro-TM/PLpro對細胞內(nèi)泛素化水平的影響。
　　結果:1.MERS PLpro-TM高級空間結構研究:以SARS PLpro蛋白酶為預測模板,利用生物信息學預測MERS PLpro高級空間結構。結果顯示,MERS-CoV PLpro與SARS-CoV PLpro及兩者的蛋白酶催化活

8、性位點的高級空間結構存在一定程度的相似性。
　　2.MERS PLpro-TM特異性地切割釋放底物蛋白:在HEK293T細胞中,MERS PLpro-TM可以完全切割釋放蛋白酶底物 nsp2-3,部分切割釋放底物 nsp1-2和nsp3-4。分別突變MERS PLpro-TM的各個蛋白酶催化活性中心后,發(fā)現(xiàn)各個蛋白酶底物的切割釋放產(chǎn)物量均有所降低。此外,實驗結果顯示當?shù)孜锏鞍酌傅母叨缺Ｊ匦蛄斜煌蛔兒?PLpro-TM對底物蛋白酶的

9、切割釋放明顯減弱。提示MERS-CoV PLpro-TM特異性識別并切割底物蛋白酶的高度保守序列,且此切割作用受PLpro-TM蛋白酶催化活性位點影響。
　　3.MERS PLpro-TM是人類冠狀病毒編碼的一種新 IFN拮抗蛋白:在 HEK293T細胞中,MERS PLpro-TM及其一系列蛋白酶活性突變體均可抑制 RIG-IN介導的細胞內(nèi)IFN表達,并通過破壞細胞內(nèi)IRF3磷酸化進而破壞IRF3通路的活化,暗示著MERS-Co

10、V PLpro-TM主要通過破壞細胞內(nèi)IRF3通路的活化從而抑制干擾素表達。
　　4.MERS PLpro-TM是人類冠狀病毒編碼的一種新 DUB酶:將泛素分子(HA-Ub,HA-Ub K48,HA-Ub K63)分別與MERS PLpro/PLpro-TM基因共同轉入HEK293T細胞,發(fā)現(xiàn)MERS PLpro/PLpro-TM能有效地去除細胞內(nèi)泛素化修飾的蛋白(包括K63、K48修飾的泛素化),從而證實MERS PLpro-T

11、M/PLpro具有細胞內(nèi) DUB活性,且 PLpro的DUB活性存在蛋白酶催化活性依賴性,然而 MERS PLpro-TM不存在此種依賴性。提示MERS PLpro的蛋白酶活性與其DUB活性存在必然聯(lián)系,且MERS PLpro-TM的DUB活性呈現(xiàn)一定程度的TM依賴性。
　　結論:MERS-CoV編碼的木瓜樣蛋白酶 PLpro-TM通過識別高度保守序列LXGG完成對蛋白酶底物的特異性切割,且此活性主要依賴于其蛋白酶催化活性中心;同