大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)HIF-1α基因轉(zhuǎn)染后生物學(xué)特性的實驗研究.pdf

1、脊髓壓迫、脊柱外傷、脊髓組織供血動脈疾患、外科手術(shù)中胸腹相關(guān)動脈的阻斷、損傷或循環(huán)血容量的急劇減少等因素均可引起脊髓缺血，從而導(dǎo)致脊髓損傷(SpinalCordInjury,SCI)。當(dāng)涉及的相關(guān)缺血因素去除后，脊髓組織雖可恢復(fù)灌注，但功能卻得不到改觀，反而進(jìn)一步加重先前由于缺血造成的損害，形成脊髓缺血再灌注損傷(SpinalCordIschemia-ReperfusionInjury,SCII)。長期以來，脊髓缺血再灌注損傷后的高致殘

2、率和高死亡率嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量。如何恢復(fù)損傷后神經(jīng)元功能并改善局部微環(huán)境已成為國內(nèi)外研究的熱點。由于造成SCII的病理生理機(jī)制復(fù)雜，治療難度高，目前尚未有一個高效的治療方法，對其治療仍處于探索階段。目前SCII的研究已深入到基因和細(xì)胞水平，基因治療、細(xì)胞移植是全新的治療途徑，近年來發(fā)展迅速，主要針對神經(jīng)功能的修復(fù)和微環(huán)境的改善，技術(shù)關(guān)鍵是選擇有效的目的基因和載體細(xì)胞，這些治療方式有望在治療脊髓缺血再灌注損傷領(lǐng)域中取得突破。

3、　　研究表明，低氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia-inducibleFactor-1α,HIF-1α）在機(jī)體低氧應(yīng)答中可大量產(chǎn)生，并處于關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并與DNA特定序列結(jié)合而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯，在缺氧后細(xì)胞凋亡及微循環(huán)的改善等方面起重要作用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs）在神經(jīng)元的增殖、分化和遷移方面起促進(jìn)作用，有助損傷神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)。
　　因此我們設(shè)想通過合理

4、有效的方式把兩者結(jié)合起來。企望采取細(xì)胞移植與基因治療相結(jié)合技術(shù)，發(fā)揮HIF-1α基因調(diào)節(jié)缺氧應(yīng)答和BMSCs細(xì)胞移植的雙重作用，為SCII救治探索新的策略。
　　實驗一：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及HIF-1α基因轉(zhuǎn)染后的相關(guān)檢測
　　目的：分離并培養(yǎng)BMSCs，并完成HIF-1α基因轉(zhuǎn)染后的相關(guān)檢測。
　　方法：選擇全骨髓貼壁篩選法分離、培養(yǎng)BMSCs，采用倒置相差顯微鏡、流式細(xì)胞儀、誘導(dǎo)成骨、成脂肪細(xì)胞的方法鑒定所

5、培養(yǎng)細(xì)胞；利用電穿孔技術(shù)將前期構(gòu)建成功的帶有熒光標(biāo)記的基因表達(dá)載體pcDNA3.1-HIF-1α轉(zhuǎn)染入BMSCs，熒光顯微鏡觀察是否成功轉(zhuǎn)染。
　　結(jié)果：培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過一系列鑒定符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特點，BMSCs經(jīng)過轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)紅色熒光顆粒。
　　結(jié)論：全骨髓貼壁篩選法可成功分離并獲取實驗所需BMSCs，電穿孔方法可將HIF-1α基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入BMSCs。
　　實驗二：經(jīng)基因修飾后低氧條件下BMSCs生物

6、學(xué)特性的實驗研究
　　目的：探討低氧條件下經(jīng)基因修飾后BMSCs生物學(xué)特性。
　　方法：建立物理性低氧環(huán)境，將基因成功轉(zhuǎn)染后的BMSCs、單純BMSCs、僅轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒的BMSCs在該環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)8天，分別命名為BMSCs-HIF-1α組，BMSCs組，BMSCs-pcDNA3.1組。采用WesternBlot檢測HIF-1α基因蛋白水平表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡；MTT法測定細(xì)胞生長曲線，觀察細(xì)胞生物

7、學(xué)特性。
　　結(jié)果：WesternBlot顯示BMSCs-HIF-1α組的蛋白表達(dá)量明顯高于其余兩組，BMSCs-pcDNA3.1、BMSCs組的蛋白表達(dá)較低，兩兩比較沒有明顯差異，流式細(xì)胞儀檢測表明BMSCs-HIF-1α組細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）高于其余兩組,凋亡率明顯小于其他組;MTT結(jié)果提示相同條件下，BMSCs-HIF-1α組細(xì)胞生長狀態(tài)明顯好于其他兩組。
　　結(jié)論：大鼠BMSCs經(jīng)HIF-1α基因轉(zhuǎn)染后，低氧環(huán)境下生

8、物學(xué)特性在一定程度上得到增強。
　　實驗三：CoCl2誘導(dǎo)的化學(xué)性低氧對基因修飾后BMSCs生物學(xué)特性的影響
　　目的：探討氯化鈷（CoCl2）在模擬化學(xué)性缺氧中對基因修飾后BMSCs生物學(xué)特性的影響。
　　方法：將化學(xué)性低氧誘導(dǎo)劑CoCl2加入到基因轉(zhuǎn)染后的BMSCs、單純BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)基中模擬低氧環(huán)境，保持終濃度為150μM，連續(xù)觀察8天。（細(xì)胞分組記為：BMSCs-HIF-1α-CoCl2組、BMSCs-Co

9、Cl2組）。并同物理性缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞（記為對照組）進(jìn)行比較，（細(xì)胞分組為：BMSCs-HIF-1α組、BMSCs組）。WesternBlot測定細(xì)胞內(nèi)HIF-1α基因的蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞周期以及凋亡；MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，觀察細(xì)胞增殖。
　　結(jié)果：與BMSCs-HIF-1α組比較，BMSCs-HIF-1α-CoCl2組細(xì)胞內(nèi)HIF-1α表達(dá)上調(diào)，G2期以及S期細(xì)胞比例及增值指數(shù)PI升高，G1期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞數(shù)