纖維蛋白原、纖維蛋白及其降解產物參與動脈粥樣硬化的分子機制研究.pdf

1、目的：探討不同濃度水平的纖維蛋白原（Fg）及其降解產物（Fb和FDPs）在動脈粥樣硬化（AS）發(fā)病中的作用及其分子機制。 方法：①以Transwell膜為載體，建立原代培養(yǎng)的兔主動脈內皮細胞（ECs）和平滑肌細胞（SMCs）共培養(yǎng)體系，對兩種細胞的生長特性和SMCs的正常表型轉換規(guī)律進行觀察。②應用不同濃度（0mg/ml、0.5mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml和6.0mg/ml）Fg、Fb和FDP

2、s對共培養(yǎng)體系進行干預，觀察該體系中SMCs的蛋白合成（BCA法）、細胞表型轉換標志物α—SM—actin（RT—PCR法）、增殖細胞核抗原（PCNA）（western blot法）以及細胞移行（刮傷模型）變化。③應用在不同濃度Fg、Fb和FDPs干預共培養(yǎng)體系后，分別從基因轉錄（RT—PCR法）、蛋白表達（ELISA法）和活性交化（發(fā)色底物法，明膠酶譜法/MTT法）水平檢測該體系tPA、PAI—1、MMP—2、—8和VEGF的表達情況

3、，并觀察在此過程部分濃度組別中ECs和SMCs核轉錄因子（NF）—κB途徑活化情況。④應用HE染色對人AS不穩(wěn)定斑塊進行了組織學觀察、篩選，然后利用免疫熒光雙標技術和激光共聚焦顯微鏡觀察MMP—2、—8和VEGF在人不穩(wěn)定斑塊上的定位共表達情況。 結果：⑴原代培養(yǎng)的兔主動脈ECsⅧ因子抗體免疫組化染色呈陽性。在共培養(yǎng)條件下，ECs和SMCs在Transwell膜上生長良好，ECs單層生長，呈“鵝卵石”樣外觀；SMCs多層生長，呈

4、明顯“蜂—谷”狀外觀。膜兩側的ECs和SMCs可以發(fā)生細胞連接。從第3天開始SMCs表現(xiàn)為增殖表型的形態(tài)特征，第6天以后，出現(xiàn)收縮表型的形態(tài)特征。⑵較高濃度的Fg（≥3.0mg/ml）可明顯促進SMCs的蛋白合成、PCNA表達以及趨化遷移，同時抑制SMCsα—SM—actin的轉錄過程；Fb從0.5mg/ml起就可明顯促進SMCs的蛋白合成。1.5—4.5mg/ml的Fb可明顯上調PCNA表達，濃度過高的Fb（6.0mg/ml）反而抑制

5、其表達。3.0—6.0mg/ml的Fb顯著促進SMCs趨化，下調α—SM—actin mRNA的表達，但從1.5mg/ml起Fb就可明顯加強SMCs的遷移過程；在0.5—6.0mg/ml之間，F(xiàn)DPs呈濃度依賴性地促進SMCs蛋白合成、PCNA表達和移行，但只有較高濃度的FDPs（3.0—6.0mg/ml）可顯著抑制SMCs向收縮表型轉換。⑶Fg對tPA的表達沒有顯著影響，較高濃度的Fg（3.0—4.5mg/ml）可明顯促進PAI—1m

6、RNA表達、抗原含量及活性升高，但過高濃度的Fg（6.0mg/ml）卻抑制PAI—1的表達；3.0—4.5mg/ml的Fb對tPA mRNA和抗原含量都起上調作用，同時顯著下調tPA活性；較高濃度的Fb（1.5—4.5mg/ml）則可明顯上調PAI—1的表達，且在mRNA、蛋白和活性水平趨勢基本一致；3.0—6.0mg/ml的FDPs均可明顯下調tPAmRNA、蛋白表達和活性水平，1.5—6.0mg/ml的FDPs均可促進PAI—1的高

7、表達。⑷4.5—6.0mg/ml的Fg能明顯上調MMP—2的轉錄、蛋白表達和降解明膠的活性；3.0—6.0mg/ml濃度的Fb顯著能促進MMP—2的高表達和活性上調；在觀察的FDPs濃度（0.5—6.0mg/ml）范圍內，MMP—2 mRNA里濃度依賴性高表達；但只在中高濃度（1.5—6.0mg/ml）FDPs亞組上清中檢測到MMP—2抗原含量顯著升高和活性上調。而中濃度（1.5mg/ml）以上的Fg及其降解產物Fb和FDPs均可促進V

8、EGF的高表達，這在mRNA、蛋白和活性水平趨勢基本一致。3.0—6.0mg/ml的Fg、1.5—6.0mg/ml的Fb和FDPs均可呈濃度依賴性地顯著上調細胞上清中MMP—8水平，但在過高濃度（6.0mg/ml）的亞組都略有下降，但仍明顯高于空白對照組。在中高濃度（3.0—6.0mg/ml）的Fb和FDPs干預下，ECs和SMCs均見到NF—xB激活，NF—κB特異拮抗劑SN50能抑制ECs和SMCs MMP—2和VEGF的表達，對M

9、MP—8的表達卻沒有影響。⑸所有病例均有AS斑塊的組織學特征，且均為Ⅳ型以上的不穩(wěn)定性斑塊；MMP—2在單核細胞浸潤的斑塊纖維帽平滑肌細胞和肩部單核細胞中表達最為顯著，在肩部和脂質壞死區(qū)邊緣增生微血管內皮細胞中也有較多表達；MMP—8表達最多見于纖維帽和脂質核心內的單核細胞中，其次共表達在纖維帽的平滑肌細胞中，內皮細胞中表達很弱很少；VEGF在肩部增生的微血管內皮細胞中表達最為明顯，由平滑肌細胞構成的纖維帽和有較多單核細胞浸潤的脂質壞死

10、區(qū)邊緣也是VEGF的高表達區(qū)域。 結論：①成功建立了兔主動脈ECs—SMCs共培養(yǎng)體系，該體系能較好地模擬血管壁的結構關系，有很好的生物相容性，不影響細胞的生物活性和生長特性。②一定濃度的Fg、Fb及FDPs可以促進SMCs增殖和異常表型轉換、影響其趨化遷移過程，同時可調控血管ECs tPA和PAI—1的表達，降低血液纖溶活性，從而參與了AS的發(fā)生發(fā)展。③Fg、Fb及FDPs通過影響血管ECs—SMCs MMP—2、—8和VEG