納米細菌對兔主動脈血管平滑肌細胞生物學形態(tài)的影響和機制探討.pdf

1、第一部分動脈粥樣硬化斑塊中納米細菌的培養(yǎng)與鑒定。 目的：研究動脈粥樣硬化斑塊中是否存在納米細菌，并對其進行鑒定。 方法：將手術中采獲的12例動脈粥樣硬化斑塊及12例正常動脈血管組織研磨，取上清液培養(yǎng)。培養(yǎng)8周后收集培養(yǎng)瓶底的白色粉末，用納米細菌單克隆抗體間接免疫熒光法對其進行鑒定，并利用電鏡進一步觀察其形狀。對收獲的納米細菌進行再培養(yǎng)，每周檢測一次培養(yǎng)基上清液K<'+>、Na<'+>、Cr<'->、Mg<'2+>、Ca<

2、'2+>、P<'3->及葡萄糖的濃度。 結果：12 例動脈粥樣硬化斑塊中10例納米細菌檢測陽性，2 例陰性，12例正常動脈血管組織中1例納米細菌檢測陽性，11例陰性，卡方檢驗存在顯著性差異(P<0.05)。納米細菌單克隆抗體間接免疫熒光法檢測時，納米細菌可發(fā)出綠色熒光，透射電鏡下測量納米細菌直徑大小約為100～300nm。培養(yǎng)過程中上清液的K<'+>、Na<'+>、Cr<'->、Mg<'2+>及葡萄糖的濃度無明顯變化(P>0.0

3、5)；而Ca<'2+>、P<'3->濃度進行性下降，每周檢測結果比較存在顯著性差異(P<0.05)。 結論：動脈粥樣硬化斑塊中存在納米細菌，它可能導致粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定。納米細菌單克隆抗體間接免疫熒光法可以幫助鑒定納米細菌。納米細菌在培養(yǎng)過程中消耗Ca<'2+>、P<'3->而不利用K<'+>、Na<'+>、Cl<'->、Mg<'2+>及葡萄糖。 第二部分納米細菌對免主動脈血管平滑肌細胞生物學形態(tài)的影響。 目的：

4、觀察納米細菌對兔主動脈血管平滑肌細胞是否具有損傷作用及鹽酸四環(huán)素干預能否減輕這種損傷。 方法：光鏡下觀察不同濃度納米細菌攻擊及1.95μg/ml 鹽酸四環(huán)素干預48h和72h后的兔主動脈血管平滑肌細胞形態(tài)學改變；四唑鹽(MTT)比色實驗檢測不同濃度納米細菌攻擊和1.95μg/ml鹽酸四環(huán)素干預48h和72h后的平滑肌細胞存活和增殖情況；流式細胞儀檢測不同濃度納米細菌攻擊和 1.95μg/ml鹽酸四環(huán)素干預24h后的平滑肌細胞凋亡

5、情況。 結果：不同濃度納米細菌攻擊后血管平滑肌細胞形態(tài)存在不同程度改變，極低濃度時(OD=0.001，0.005)無明顯變化，隨濃度增加和時間延長，平滑肌細胞逐漸出現(xiàn)空泡樣變，輪廓不清，細胞膜損傷破裂，嚴重時血管平滑肌細胞被完全破壞。鹽酸四環(huán)素干預后發(fā)現(xiàn)極低濃度(OD=0.001，0.005)和低濃度(OD=0.01，0.03,0.05)的納米細菌攻擊對血管平滑肌細胞形態(tài)學無明顯影響，但高濃度納米細菌(OD=0.1，0.3)仍可

6、導致大部分平滑肌細胞損傷和壞死。不同濃度納米細菌攻擊48h后：除OD=0.001組外各濃度組MTT值低于對照組MTT值，存在顯著性差異(P<0.05)，各濃度組MTT值之間比較存在顯著性差異(P<0.05)。攻擊72h后：各濃度組MTT值均低于對照組MTT值，存在顯著性差異(P<0.05)，OD=0.1組和OD=0.3組的MTT值比較無顯著性差異(P>0.05)，其余各濃度組之間比較存在顯著性差異(P<0.05)。每一濃度納米細菌攻擊4

7、8h和72h后：OD=0.001，0.005時72h的MTT值高于48h的MTT值，存在顯著性差異(P<0.05)。OD=0.01，0.03，0.05，0.1時72h的MTT值低于48h的MTT值，存在顯著性差異(P<0.05)。OD=0.3時48h的MTT值和72h的MTT值比較無顯著性差異。鹽酸四環(huán)素干預48h及72h后：納米細菌(OD=0.001，0.005，0.01，0.03，0.05，0.1)攻擊后的平滑肌細胞MTT值低于鹽酸

8、四環(huán)素干預后MTT值，統(tǒng)計學比較存在顯著性差異(P<0.05)。納米細菌(OD=0.3)攻擊后的血管平滑肌細胞MTT值與鹽酸四環(huán)素千預后MTT值比較未見顯著性差異(P>0.05)。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)：不同濃度納米細菌攻擊24h后，未見明顯血管平滑肌細胞凋亡，鹽酸四環(huán)素干預后各濃度組也未見明顯細胞凋亡。 結論：納米細菌可以損傷兔主動脈血管平滑肌細胞，濃度越高，攻擊時間越長，損傷程度越重；短時間內(nèi)(24小時)被納米細菌攻擊的血管平滑

9、肌細胞的死亡方式是壞死而不是凋亡；鹽酸四環(huán)素可以減輕納米細菌對血管平滑肌細胞的損傷。 第三部分納米細菌損傷兔主動脈血管平滑肌細胞機制的初步探討。 目的：從自由基的角度初步探討納米細菌對兔主動脈血管平滑肌細胞的損傷機制。 方法：0.5Mcfarland 濃度納米細菌攻擊兔主動脈血管平滑肌細胞，分別在0、12、24、48、72小時各時間點取培養(yǎng)基上清液，按照試劑盒說明檢測乳酸脫氫酶(lactate dehydroge

10、nase,LDH)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和一氧化氮(nitric oxide,NO)的變化。 結果：隨著攻擊時間的延長，LDH 濃度逐漸升高，與對照組比較存在顯著性差異，各時間點比較存在顯著性差異(P<0.05)；SOD的活性隨攻擊時間延長而逐漸升高，與對照組比較存在顯著性差異，各時間點比較存在顯著性差異(P<0.05)；MDA含量