RNA干擾BCK1基因治療卡氏肺孢子肺炎的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)研究構(gòu)建BCK1基因miRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染體外提純培養(yǎng)卡氏肺孢子(Pneumocystis carinii,PC)，通過觀察其包囊增殖情況，電鏡下觀察轉(zhuǎn)染后PC超微機(jī)構(gòu)變化以及RT-PCR觀察BCK1基因受干擾情況，初步探討RNA干擾技術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)PC的抑制效果。 方法：連續(xù)地塞米松皮下注射正常wistar大鼠6W，誘導(dǎo)卡氏肺孢子肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia PCP)動(dòng)物模型；依據(jù)s

2、iRNA設(shè)計(jì)原則，結(jié)合PC BCK1基因序列特征，借助生物學(xué)信息學(xué)軟件在線設(shè)計(jì)兩對(duì)靶向PC BCK1基因的siRNA。應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建BCK1基因短發(fā)價(jià)狀siRNA質(zhì)粒干擾載體。提純并體外培養(yǎng)PC細(xì)胞，利用脂質(zhì)體將siRNA轉(zhuǎn)染入PC細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立GFP轉(zhuǎn)染對(duì)照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組、未經(jīng)任何處理空白陰性對(duì)照組。根據(jù)每日熒光顯微鏡下觀察熒光個(gè)數(shù)，選用最優(yōu)轉(zhuǎn)染方法；采用GMS染色，計(jì)數(shù)每日包囊數(shù)變化情況，根據(jù)每隔1d PC包囊計(jì)數(shù)情況，

3、對(duì)不同組別，觀察d數(shù)及重復(fù)次數(shù)等各因素進(jìn)行多因素方差分析，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS計(jì)算出F值。作用72h后掃描電鏡觀察空白組及重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組PC蟲體超微結(jié)構(gòu)變化情況，RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后PC BCK1基因表達(dá)變化情況。 結(jié)果：成功建立卡氏肺孢子肺炎大鼠模型，成功構(gòu)建2種BCK1siRNA真核表達(dá)載體，命名為BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2。轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)PC經(jīng)GMS染色并計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)BCKl siRNA能夠影響體外培養(yǎng)P

4、C包囊的增殖，與空白對(duì)照組相比，BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2對(duì)PC增殖抑制率分別為35.4％和42.5％。通過掃描電鏡觀察可見siRNA真核表達(dá)載體組PC超微機(jī)構(gòu)出現(xiàn)不同程度細(xì)胞壁破損等改變。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)BCK1基因mRNA表達(dá)發(fā)生抑制，BCK1-shRNA1和BCK1-shRNA2對(duì)PC mRNA表達(dá)的抑制率分別為57.38％～I(xiàn) 64.45％。 結(jié)論：BCK1 siRNA真核表達(dá)載體能通過有效干擾P