小鼠腫瘤細(xì)胞TLR2的表達(dá)及其生物學(xué)意義.pdf

1、Toll樣受體(tolllikereceptors，TLRs)是果蠅Toll的同系物，它們廣泛存在于植物及動(dòng)物體內(nèi)，是物種進(jìn)化保留下來(lái)的保守序列。自1997年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)哺乳動(dòng)物TLRs以來(lái)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的TLRs有12個(gè)。這些進(jìn)化保守的受體與果蠅的Toll蛋白在結(jié)構(gòu)上有高度的同源性，識(shí)別表達(dá)在病原微生物或其裂解產(chǎn)物上高度保守的結(jié)構(gòu)基序，繼而引發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起重要作用，同時(shí)也可激活獲得性免疫系統(tǒng)。TLRs家

2、族的作用并不僅僅限于抗感染免疫，在自身免疫病、超敏反應(yīng)、移植排斥、缺血再灌注損傷及腫瘤免疫中也發(fā)揮作用。 TLR2是TLRs家族中識(shí)別范圍最廣的成員，在過(guò)去的幾年中得到了廣泛的研究。本研究擬對(duì)多種組織來(lái)源的小鼠腫瘤細(xì)胞TLR2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，然后觀察TLR2的激動(dòng)劑對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響；同時(shí)構(gòu)建含TLR2反義序列的質(zhì)?！猵cDNA3.1(-)-mTLR2(-)，并將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入NS-1細(xì)胞株內(nèi)，下調(diào)NS-1細(xì)胞株TLR2

3、的表達(dá)水平，通過(guò)在小鼠體內(nèi)建立腫瘤模型來(lái)觀察TLR2在腫瘤中的作用。 一、小鼠腫瘤細(xì)胞TLR2表達(dá)及穩(wěn)定表達(dá)反義TLR2的NS-1細(xì)胞株的建立 根據(jù)已發(fā)表的檢測(cè)小鼠TLR2及β-actin的文獻(xiàn)合成兩對(duì)引物：P1、P2(TLR2)和P3、P4(β-actin)。Trizol提取小鼠腫瘤細(xì)胞株EMT-6、RM-1、SP2/0、YAC-1，F(xiàn)BL3、NS-1、RAW264.7和對(duì)照細(xì)胞株人淋巴瘤U937總RNA，以O(shè)ligo

4、(dt)18為引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；然后再以cDNA為模板，分別用P1、P2和P3、P4為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果以P3、P4為引物的PCR反應(yīng)，均擴(kuò)增出約350bp的特異性擴(kuò)增帶。而以P1、P2為引物的PCR反應(yīng)，除U937細(xì)胞株外，其他細(xì)胞株均擴(kuò)增出約310bp的特異性擴(kuò)增帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定后，在線(xiàn)運(yùn)行BLAST2，與mTLR2cDNA序列AF124741作比較，其同源性均＞98％。以PE標(biāo)記的TLR2單抗T2.5，

5、采用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)各種小鼠腫瘤細(xì)胞表面TLR2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)除YAC-1以外其他所有的細(xì)胞株表面都不同程度的表達(dá)TLR2，其中上皮細(xì)胞癌EMT-6和RM-1可表達(dá)TLR2蛋白系本課題組首次報(bào)道。 構(gòu)建反義mTLR2的重組體pcDNA3.1(-)-mTLR2(-)。pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)這兩個(gè)質(zhì)粒均為5.4kbp，結(jié)構(gòu)相似，均含有CMV、SV40、T7啟動(dòng)子，Amp、Neo抗性基因和相同的多克隆酶切

6、位點(diǎn)，但二者的多克隆酶切位點(diǎn)排列方向剛好相反，我們正是利用這一點(diǎn)，以真核表達(dá)重組體pcDNA3.1(+)-mTLR2為模板，擴(kuò)增出兩端分別加有NotI和XbaI酶切位點(diǎn)的mTLR2DNA片段，然后與pcDNA3.1(-)進(jìn)行連接，剛好使其反向插入，就構(gòu)建成pcDNA3.1(-)-mTLR2(-)反義重組體。經(jīng)測(cè)序鑒定，插入T7啟動(dòng)子下游的目的片段與mTLR2的序列反向互補(bǔ)；NotI和XbaI雙酶切構(gòu)建的反義重組體，得到約5400bp的載

7、體片段和2350bp的目的片段，表明成功構(gòu)建了反義mTLR2的重組體。 將pcDNA3.1(-)-mTLR2(-)反義重組體在250V電壓和900uF電容的條件下電轉(zhuǎn)進(jìn)入NS-1細(xì)胞株，經(jīng)含600mg/LG418的RPMI1640完全培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)3周，獲得陽(yáng)性克隆——NS-1-mTLR2(-)。同時(shí)以pcDNA3.1(-)空載體電轉(zhuǎn)NS-1細(xì)胞株作為陰性對(duì)照，所得陽(yáng)性克隆命名為NS-1-pcDNA3.1(-)。 二、T

8、LR2激動(dòng)劑對(duì)腫瘤形成及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響的初步觀察卡介苗(BCG)是TLR2的激動(dòng)劑之一，這里采用包含有BCG的弗氏完全佐劑來(lái)處理小鼠腫瘤模型。SWISS小鼠各10只，分別腹腔注射0.2ml的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，10天后，各組小鼠再追加注射0.2ml的弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑。之后第15天，以小鼠骨肉瘤S180細(xì)胞株接種小鼠背部皮下，1.0×105個(gè)/只；對(duì)照組僅接種相同數(shù)量的腫瘤細(xì)胞。觀察成瘤時(shí)間和瘤體大小。結(jié)果顯示：注

9、射弗氏完全佐劑的小鼠形成腫瘤的潛伏期較長(zhǎng)，并且生存時(shí)間也較長(zhǎng)，與弗氏不完全佐劑組相比較，具有顯著性差異(P=0.023)，但與空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(P=0.147)；弗氏完全佐劑組形成較大實(shí)體瘤的數(shù)量為3只(30％)，與空白對(duì)照組(8只，80％)相比較具有顯著性差異(P=0.032)，但是與不完全佐劑組(7只，70％)相比較，則沒(méi)有顯著性差異(P=0.078)。 以SWISS小鼠骨肉瘤S180細(xì)胞株1.0×105個(gè)/只接種小

10、鼠背部皮下，其中實(shí)驗(yàn)組分別摻入50ug、100ug和250ug的PGN，50ug、100ug和250ug的TSP-3抗體，陰性對(duì)照組分別摻入50ug、100ug和250ug兔同型抗體，空白對(duì)照組僅接種S180。觀察35天，記錄各組成瘤數(shù)量。雖然100ug和250ug的PGN組顯示出對(duì)成瘤的抑制趨勢(shì)，但經(jīng)Fisher精確概率法分析，實(shí)驗(yàn)組在成瘤數(shù)量上與空白及陰性對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。 選取3種膜表面表達(dá)TLR2的細(xì)

11、胞株FBL3、SP2/0、NS-1以及不表達(dá)TLR2分子的細(xì)胞株YAC-1，均以1.0×104個(gè)為起始細(xì)胞數(shù)量，以含10％的新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，在3復(fù)孔、每孔200ul的反應(yīng)體系中，分別以90ug/ml、30ug/ml、10ug/ml和0ug/ml的PGN進(jìn)行刺激，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)48小時(shí)。然后每孔摻入CCK-8(cellcountingkit8)10ul，4-6小時(shí)之后450nm讀數(shù)，記錄每孔OD值。