miRNA-34a-KLF4在X射線誘導肝細胞凋亡時的調節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　探討miR-34a/KLF4在X射線外照射誘發(fā)小鼠肝細胞凋亡時的調節(jié)作用機制，為進一步闡明miR-34a在電離輻射損傷發(fā)生中的作用提供實驗依據，并推動以其為靶點的輻射損傷救治新手段的探索。
　　方法：
　　1.雙熒光素酶活性實驗檢測miR-34a對KLF4的靶向作用。對數生長期的小鼠肝細胞瞬時轉染miR-34a模擬物和抑制劑后，Real-Time PCR方法檢miR-34a和KLF4 mRNA表達，west

2、ern blot蛋白印記法檢測KLF4蛋白表達。
　　2.對數生長期的小鼠肝細胞，經10Gy X射線照射后不同時間點收集細胞，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡變化，Real-Time PCR方法檢測miR-34a表達。瞬時轉染miR-34a模擬物和抑制劑后，流式細胞儀檢測10Gy X射線照射小鼠肝細胞凋亡變化。慢病毒干擾KLF4后，流式細胞儀檢測10Gy X射線照射小鼠肝細胞凋亡變化。
　　結果：
　　1.生物信息學軟件預測

3、，發(fā)現miR-34a在KLF4-3'UTR有一個序列保守的潛在靶位點。為了驗證miR-34a和KLF4的靶點作用關系，構建了含KLF4-3'UTR結合序列的報告基因質粒。雙熒光素酶活性實驗發(fā)現，miR-34a可顯著抑制KLF4-3'UTR結合序列的報告基因質粒的熒光素酶活性。此外，實時定量PCR(real time PCR)及免疫印跡(western blot)分析結果顯示，肝細胞內KLF4的mRNA水平和蛋白水平表達均受到miR-34

4、a的抑制。
　　2.小鼠肝細胞系BNL CL.2經10Gy X射線照射后，miR-34a的表達顯著上升?？梢?，10Gy X射線照射可上調肝細胞中 miR-34a的表達水平。分別利用成熟miR-34a模擬物(miR-34a mimics)過表達和miR-34a抑制劑(miR-34a inhibitor)下調肝細胞內源miR-34a的水平并檢測肝細胞凋亡情況的變化。結果顯示，miR-34a模擬物可顯著促進肝細胞凋亡。相反，miR-34