細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴在青蒿素干預(yù)下的基因轉(zhuǎn)錄譜分析.pdf

1、目的：利用基因芯片技術(shù)研究青蒿素(ART)干預(yù)影響細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴存活的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，推測ART抗包蟲病的分子機(jī)制。
　　方法：從屠宰場宰殺綿羊的肝包囊獲得細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴，體外短暫培養(yǎng)后留實(shí)驗(yàn)用，選擇以10天為干預(yù)周期，200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL為ART干預(yù)濃度，確定用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的ART濃度及作用時間，透射電子顯微鏡鏡觀察（transmission electron

2、 microscope，TEM）ART及陽性對照藥阿苯達(dá)唑（ABZ）干預(yù)原頭蚴后超微結(jié)構(gòu)的變化，提取原頭蚴總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用細(xì)粒棘球絳蟲功能基因組微陣列基因芯片檢測ART、ABZ、溶劑二甲基亞砜（DMSO）體外干預(yù)細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴前后的差異表達(dá)基因，聯(lián)機(jī)檢索MAS3.0（Molecular Annotation System3.0，北京博奧公司）數(shù)據(jù)庫，對差異基因進(jìn)行功能注釋，并按照參與的通路和基因的功能分別進(jìn)行基因分類

3、，并以實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）對基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ART體外抗原頭蚴活性優(yōu)于ABZ；TEM觀察發(fā)現(xiàn)ART主要引起原頭蚴細(xì)胞核核破裂，核仁消失，核內(nèi)物質(zhì)顏色變深，異染色質(zhì)邊聚等現(xiàn)象。ART組基因芯片結(jié)果共有106個基因表達(dá)水平發(fā)生改變，其中100個表達(dá)上調(diào)，6個表達(dá)下調(diào)；陽性對照ABZ組共有42個基因表達(dá)水平發(fā)生改變，其中7個表達(dá)上調(diào)，35個表達(dá)下調(diào)，溶劑1％DMSO組只有4個表達(dá)上調(diào)

4、；本研究中有9個共同差異表達(dá)基因，其中ART和ABZ干預(yù)組有8個共同差異表達(dá)基因。ART組差異表達(dá)基因在KEGG中具pathway注釋的有16個，其中3個基因與代謝相關(guān)，10個基因與遺傳信息過程相關(guān)其中4個基因與DNA修復(fù)過程相關(guān)。差異基因生物學(xué)功能分類結(jié)果顯示在ART組106個差異基因中，71個基因功能未知，余下35個基因主要涉及涉及細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期、代謝、翻譯、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、氧化還原等8類，ABZ組45個差異基因中，2

5、7個未知基因，余下的18個基因主要涉及細(xì)胞骨架、代謝、氧化還原、細(xì)胞周期、生物合成、翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)等7類。ABZ體外干預(yù)原頭蚴后導(dǎo)致的部分差異基因所注釋結(jié)果和文獻(xiàn)中已知的ABZ作用機(jī)制相符合。qRT-PCR驗(yàn)證其中17個差異基因，驗(yàn)證結(jié)果中14個基因（包括在ART組、ABZ組中具有共同差異表達(dá)的基因）與基因芯片篩選的差異基因結(jié)果一致，其中384P10_M_17、384P09_J_05、384P17_O_09基因qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與基因芯

6、片結(jié)果不一致。
　　結(jié)論：ART體外具有抗細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴作用，與劑量、時間呈依賴性關(guān)系。ART體外殺細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴是通過多靶位作用來實(shí)現(xiàn)的，其基因表達(dá)譜的改變涉及多個途徑，可能存在的主要機(jī)制為影響細(xì)粒棘球絳蟲的遺傳信息過程及代謝過程，其中ART對于 DNA的損傷可能是主要機(jī)制之一。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明細(xì)粒棘球絳蟲功能基因組微陣列基因芯片用于細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴在青蒿素干預(yù)下的基因轉(zhuǎn)錄譜結(jié)果可信。該研究有助于為闡明ART