臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、生物學(xué)特性和臍血單個(gè)核細(xì)胞移植治療新生鼠缺氧缺血性腦損傷的研究.pdf

1、目的:研究臍帶血(human umbilical cord blood，HUCB)來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)體外分離、純化及培養(yǎng)的條件，以建立穩(wěn)定的體外培養(yǎng)體系，滿足實(shí)驗(yàn)和臨床的需要，并將臍血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)移植到發(fā)生缺氧缺血性腦病的新生鼠腦內(nèi)，觀察其是否可以存活、分化及大鼠的學(xué)習(xí)和記憶變化。 方法:密度梯度法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞。16份臍血每份分為3組，分別將單個(gè)核細(xì)胞按密度

2、1×10<'4>/ml、1×10<'6>/ml和1×10<'8>/ml接種于未包被6孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入5％胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)。另20份臍血每份分為3組，以1×10<'8>/ml單個(gè)核細(xì)胞密度分別加入5％、10％和120％胎牛血清的DMEM-LG接種于胎牛血清包被的6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)。采用常規(guī)的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)Friedenstein法進(jìn)行臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)。觀察不同臍血單個(gè)核細(xì)胞的接種密度、培養(yǎng)液胎牛血清濃度和胎牛血

3、清包被培養(yǎng)皿對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的影響。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs相關(guān)抗原。將30只7d齡新生Wister大鼠隨機(jī)分成MNC移植組、假手術(shù)組和假移植組各10只。MNC移植組行腦缺氧缺血并腦內(nèi)移植5-溴脫氧尿核苷(Brdu)標(biāo)記的臍血單個(gè)核細(xì)胞；假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈但不結(jié)扎；假移植組行腦缺氧缺血，腦內(nèi)注射生理鹽水。采用Y型迷宮觀察新生鼠的行為改變，免疫組化分析腦組織移植細(xì)胞的定位和分化情況。 結(jié)果:胎牛血清未包被組以1×10<'4

4、>/ml、1×10<'6>/ml接種組培養(yǎng)7d后貼壁數(shù)量很少，貼壁的細(xì)胞未長(zhǎng)滿瓶底即死亡，無(wú)法傳代；1×10<'8>/ml組貼壁細(xì)胞較多，間充質(zhì)樣細(xì)胞與破骨樣細(xì)胞并存。1×10<'8>ml組分5％、10％、20％3種血清濃度，貼壁細(xì)胞均較多，以間充質(zhì)干細(xì)胞為主，胎牛血清濃度5％組間充質(zhì)干細(xì)胞的純度較10％及20％組高，破骨樣細(xì)胞相對(duì)較少；胎牛血清包被組與未包被組相比，貼壁細(xì)胞少，培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞純度較高，破骨樣細(xì)胞相對(duì)較少。流式細(xì)胞儀

5、檢測(cè)顯示培養(yǎng)出的間充質(zhì)樣細(xì)胞表達(dá)MSCs相關(guān)抗原。接受神經(jīng)干細(xì)胞移植組大鼠的學(xué)習(xí)能力、記憶能力和對(duì)照組相比，有明顯提高，差異具有顯著性(P<0.05)。臍血單個(gè)核細(xì)胞移植后腦組織免疫組化結(jié)果顯示：MNO移植組中，進(jìn)針注射部位存在大量移植細(xì)胞，并向周圍遷移，皮質(zhì)層、海馬等部位檢測(cè)到移植細(xì)胞；所植入的細(xì)胞約6％表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)，約8％表達(dá)神經(jīng)原特異性的微管相關(guān)蛋白2(MAP2)。 結(jié)論:將臍血單個(gè)核細(xì)胞以高密度(1×