人IL-15基因修飾NKL細(xì)胞系的生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的: NK細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫的重要組成部分是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的第一道天然防線。其殺傷功能的出現(xiàn)不需要預(yù)先刺激或致敏，無MHC(組織相容性復(fù)合物)限制性。NK細(xì)胞不僅能夠介導(dǎo)對腫瘤細(xì)胞的天然殺傷作用，還能夠調(diào)節(jié)特異性和非特異性免疫應(yīng)答。過繼轉(zhuǎn)輸活化的或同種異體的NK細(xì)胞，已經(jīng)應(yīng)用于白血病和某些實體腫瘤的治療中。 白細(xì)胞介素-15(IL-15)由多種組織和細(xì)胞亞群產(chǎn)生，與IL-2在功能上有許多相似之處，可以誘導(dǎo)CD34

2、+的細(xì)胞分化為NK細(xì)胞，并且能夠促進(jìn)NK細(xì)胞的增殖，增強NK細(xì)胞的殺傷活性。我們已經(jīng)建立了IL-15基因修飾的NK-92細(xì)胞系，證實IL-15的基因修飾能夠增強NK-92細(xì)胞對多種腫瘤的殺傷能力。 與NK-92細(xì)胞相比，NKL細(xì)胞有著不同的殺傷譜，比如，NKL對于人胃癌細(xì)胞系SGC7901的殺傷能力強于NK-92細(xì)胞，因此可以作為NK-92的重要補充。NKL細(xì)胞系由Robertson等建立，來源于CD3-CD16+CD56+的大

3、顆粒淋巴細(xì)胞自血病患者的外周血。NKL依賴于IL-2生長，具自然殺傷活性和ADCC效應(yīng)，其增殖反應(yīng)也與正常的CD16+CD56dim NK細(xì)胞相似。NKL是NK細(xì)胞系中與原始NK細(xì)胞最為相近的，因此成為過繼免疫治療的又一重要選擇。 本文建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hIL-15的NKL細(xì)胞系，證明IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞具有更強的增殖、抗凋亡和對肝癌 細(xì)胞的殺傷作用，并初步探討了其分子機(jī)制。 方法 1.電轉(zhuǎn)將IL-

4、15基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入NKL細(xì)胞系。 2.CTLL-2增殖分析測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-15的生物學(xué)活性。 3.酶聯(lián)免疫吸附分析測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-15的濃度。 4.RT-PCR檢測三種NKL細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因和殺傷相關(guān)基因的表達(dá)水平。 5.CCK方法用于分析三種NKL細(xì)胞在不同濃度IL-2和IL-15條件下的增殖水平。 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測三種NKL細(xì)胞凋亡、周期以及膜表面NKG2D和NKG2A分子

5、的表達(dá)。 7.MTT方法檢測三種NKL細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。 結(jié)論: NK細(xì)胞作為固有免疫的重要組成部分，是抵御病毒感染和腫瘤細(xì)胞的第一道防線，由于無需抗原預(yù)先作用，就可直接殺傷腫瘤和病毒感染的靶細(xì)胞，因此，在腫瘤免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過程中起重要作用。應(yīng)用NK細(xì)胞系成為腫瘤生物治療的重要手段，其中NK-92細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入期臨床試驗。為了克服NK細(xì)胞系在應(yīng)用中的某些不足，基因修飾已經(jīng)成為增強NK細(xì)胞殺傷活性的主要手段

6、。迄今為止，已有IL-2，IL-15，SCF，CD20等多種基因用于修飾NK-92細(xì)胞，取得重要進(jìn)展。 為了獲得臨床應(yīng)用的NK細(xì)胞株，我們成功建立了IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞株，IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞株在低劑量IL-2和IL-15條件下表現(xiàn)出更強的增殖能力，并且在無血清饑餓狀態(tài)下表現(xiàn)出較強的抗凋亡作用。進(jìn)一步研究表明，在IL-15基因修飾的NKL細(xì)胞中，抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-x1、Mcl-1表達(dá)水平顯著升高，