甲型流感病毒亞型間血清學(xué)交叉反應(yīng)特征研究及反向遺傳系統(tǒng)的優(yōu)化.pdf

1、甲型流感病毒嚴(yán)重危害人類健康，由于其變異引發(fā)的大流行對(duì)人類造成嚴(yán)重威脅，近年來人感染禽流感病毒(H5N1)和甲型H1N1流感的流行，進(jìn)一步提示加強(qiáng)甲型流感病毒的研究和控制的重要性。
　　 血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)是甲型流感病毒編碼的糖蛋白，變異性強(qiáng)，根據(jù)抗原性不同可進(jìn)一步分為16個(gè)HA亞型(H1～H16)和9個(gè)NA亞型(N1～N9)。盡管HA和NA是流感病毒主要的免疫原，但由于HA和NA的變異性強(qiáng)，亞型眾多，而目前甲型

2、流感病毒16個(gè)HA和9個(gè)NA不同亞型之間的免疫交叉關(guān)系尚未系統(tǒng)研究，對(duì)流感病毒亞型特異性免疫檢測(cè)技術(shù)的建立和疫苗的研發(fā)提出了嚴(yán)峻的考驗(yàn)。為此，本研究對(duì)甲型流感病毒16個(gè)亞型的HA1和9個(gè)亞型NA的交叉反應(yīng)性進(jìn)行了研究，以期闡明其免疫反應(yīng)特征，為甲型流感病毒免疫檢測(cè)技術(shù)和通用疫苗的研制提供可行性的理論依據(jù)。另一方面，近年來反向遺傳系統(tǒng)的發(fā)明為人工改造甲型流感病毒和研發(fā)疫苗提供了關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)，但現(xiàn)有系統(tǒng)的拯救效率有待提高，本研究擬通過對(duì)甲型

3、流流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄/表達(dá)載體的改建提高其拯救效率。
　　 一、甲型流感病毒HA和NA血清學(xué)交叉反應(yīng)特征研究
　　 對(duì)本實(shí)驗(yàn)選取的甲型流感病毒16個(gè)亞型的HA基因和9個(gè)亞型的NA基因的序列進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，16個(gè)HA和9個(gè)NA的核苷酸與氨基酸序列的進(jìn)化樹都主要向兩個(gè)趨勢(shì)進(jìn)化，16個(gè)HA核苷酸序列之間的同源率在28％～76.7%之間，其氨基酸序列之間的同源率在36.2%～78.5%之間，9個(gè)NA亞型核苷酸序列之

4、間的同源率在43.1%～70.4%之間，其氨基酸序列之間的同源率在37.9%～66.6%之間。盡管16個(gè)HA和9個(gè)NA基因的預(yù)測(cè)B細(xì)胞線性表位分布區(qū)域一致，但其具體表位組成卻存在差異，這些信息為進(jìn)行各亞型之間的血清學(xué)交叉反應(yīng)以及確定亞型特異性表位序列提供研究方向，進(jìn)而為研究HA和NA的結(jié)構(gòu)與功能、免疫識(shí)別、構(gòu)建HA和NA的突變體以及選擇表達(dá)新型HA和NA分子、研發(fā)診斷和基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 隨后將PCR擴(kuò)增的經(jīng)密碼子優(yōu)

5、化的16個(gè)HA1和9個(gè)NA基因克隆到改建的gp67-pFastBac1載體中，獲得了25個(gè)重組桿狀病毒。將重組桿狀病毒分別感染Sf9細(xì)胞，分別收取上清和細(xì)胞用抗6×His抗體進(jìn)行Westernblot分析。結(jié)果表明，16個(gè)HA1和9個(gè)NA基因的表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量分別約為52.5kD與71.6kD，與預(yù)期相符，并且16個(gè)HA1和9個(gè)NA基因還呈分泌性表達(dá)。其中H5-HA1和H9-HA1經(jīng)Ni柱純化后的純度達(dá)90%左右，回收率分別為0.5%和

6、0.9%。同時(shí)，將16個(gè)亞型的HA和9個(gè)亞型的NA基因克隆到5型重組腺病毒載體中，得到了25個(gè)重組腺病毒。分別將25個(gè)重組腺病毒通過滴鼻途徑免疫BALB/c小鼠，制備了相應(yīng)亞型的抗體，三次免疫后ELISA檢測(cè)陽轉(zhuǎn)率為100%，ELISA檢測(cè)的抗體效價(jià)約為1∶6400左右。利用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的各個(gè)亞型的目的蛋白作為抗原，利用重組腺病毒免疫BALB/c小鼠制備的血清作為抗體，通過ELISA方法確定16個(gè)HA亞型及9個(gè)NA亞型之間的血清學(xué)交

7、叉反應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，HA1和NA各亞型之間的交叉反應(yīng)關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，H2、H5、H7亞型與其他亞型之間的交叉反應(yīng)弱，而H6、H12、H16與其他亞型之間的交叉反應(yīng)強(qiáng)。N1、N2亞型與其他亞型之間的交叉反應(yīng)強(qiáng)，HA1和NA各亞型之間的交叉反應(yīng)結(jié)果與其序列分析的結(jié)果存在一定的差異。
　　 二、甲型流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的優(yōu)化
　　 利用RT-PCR的方法擴(kuò)增了甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)毒株8個(gè)基因片斷，克隆入p

8、ⅣⅦ載體中，其中在PB1片段中引入了3個(gè)沉默突變標(biāo)簽。將8個(gè)功能質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T和MDCK混合培養(yǎng)細(xì)胞，利用細(xì)胞病變、RT-PCR、電鏡技術(shù)等證明該系統(tǒng)可成功拯救甲型流感病毒。為提高甲型流感病毒的拯救效率，用人工合成的SCPI啟動(dòng)子[1]插入PⅣⅦ載體，構(gòu)建出pⅣVS質(zhì)粒，再將A/PR/8/34(H1N1)的8個(gè)基因片斷克隆入pⅣVS載體中，把優(yōu)化后的8個(gè)功能質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T和MDCK混合細(xì)胞，在共轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h及9