運(yùn)用光遺傳學(xué)技術(shù)探討下丘腦室旁核谷氨酸能神經(jīng)元對(duì)血壓調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究表明下丘腦室旁核中谷氨酸能輸入的增加，在高血壓發(fā)病中起主要作用。因PVN中谷氨酸的輸入不僅來(lái)源于核團(tuán)內(nèi)部，同樣也來(lái)源于下丘腦內(nèi)其他核團(tuán)以及包括海馬、前額葉皮質(zhì)以及杏仁核在內(nèi)的端腦。在神經(jīng)科學(xué)中廣泛應(yīng)用的藥理學(xué)及電刺激手段因缺乏細(xì)胞特異性及時(shí)間空間選擇性，對(duì)于明確何種來(lái)源的谷氨酸能輸入在血壓調(diào)節(jié)中起主要作用，局限性日益凸顯。通過(guò)將遺傳工程改造的光敏感蛋白和光刺激有機(jī)組合起來(lái)，光遺傳學(xué)能對(duì)復(fù)雜生物體中的特定事件，實(shí)現(xiàn)高度細(xì)胞選擇性

2、及時(shí)空分辨率的控制。因此我們利用這項(xiàng)技術(shù)不但可將PVN中的谷氨酸能神經(jīng)元分選出來(lái)，還可通過(guò)細(xì)胞類型特異性的干預(yù)，來(lái)明確其在高血壓調(diào)節(jié)中的作用，同時(shí)結(jié)合相應(yīng)的讀出系統(tǒng)（readoutsystem）來(lái)探討內(nèi)在的自主神經(jīng)及神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制。
　　材料和方法：離體實(shí)驗(yàn)部分通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的克隆技術(shù)來(lái)包裝CamKαⅡ啟動(dòng)子控制的攜帶有ChR2/eNpHR3.0-YFP融合基因的慢病毒載體，將所攜帶光敏基因特異性轉(zhuǎn)染并表達(dá)在PVN谷氨酸能神經(jīng)元中。利用

3、立體定向注射技術(shù)將病毒載體導(dǎo)入SD、WKY及SHR大鼠的PVN中（坐標(biāo)：前囟點(diǎn)后1.5mm，左右旁開(kāi)0.35mm，深7.8mm）。注射完成2星期后，用振動(dòng)切機(jī)在冰浴過(guò)的切片液中制備250μm層厚的急性活體腦片，在持續(xù)95％O2+5%CO2通氣狀態(tài)下，經(jīng)34℃ACSF孵育及室溫ACSF（23-26℃）平衡后，移至正置顯微鏡下的腦片記錄槽中，并用ACSF持續(xù)灌注。通過(guò)正置顯微鏡的YFP熒光濾片觀察由ChR2/eNpHR3.0-YFP融合蛋白

4、所形成的熒光，來(lái)判斷是否有病毒載體所攜帶基因表達(dá)，同時(shí)觀察表達(dá)位置是否在PVN；并在40倍鏡下，觀察融合蛋白的膜性表達(dá)情況，用CCD拍攝圖片。在全細(xì)胞記錄模式下，通過(guò)DG-4高速光源切換系統(tǒng)發(fā)出的藍(lán)光或黃光來(lái)分別刺激表達(dá)有ChR2或eNpHR3.0的神經(jīng)元，來(lái)觀察不同的光電反應(yīng)。在用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化技術(shù)制備得的腦片上，分別應(yīng)用興奮性神經(jīng)元標(biāo)志抗體CamKαⅡ及抑制性神經(jīng)元標(biāo)志抗體GAD67，通過(guò)觀察以上抗體所攜帶熒光與ChR2/eNpHR3

5、.0-YFP融合蛋白所形成的熒光共染情況，藉此來(lái)判斷光敏基因細(xì)胞表達(dá)的特異性。在體實(shí)驗(yàn)部分采用經(jīng)套管注射病毒的方法并將套管及基座系統(tǒng)用牙科水泥固定在顱骨表面，待病毒注射完畢，用套管內(nèi)芯插入套管并固定，以維持套管通暢，用作光神經(jīng)界面中光纖的接入及固定。為配合光神經(jīng)界面在清醒自由活動(dòng)的狀態(tài)下對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行刺激的特點(diǎn)，利用DSI遙測(cè)記錄系統(tǒng)來(lái)記錄血壓和心電圖變化，并首創(chuàng)了竇匯采血法來(lái)獲得檢測(cè)反映神經(jīng)內(nèi)分泌指標(biāo)的血樣。
　　結(jié)果：在采用經(jīng)

6、內(nèi)管病毒載體注射法10-14天后的急性活體腦片上，清楚地觀察到由ChR2/eNpHR3.0-YFP融合蛋白表達(dá)所形成的熒光，準(zhǔn)確地表達(dá)在PVN，并在40倍鏡下可觀察到光敏基因特征性的膜性表達(dá)。通過(guò)腦片全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，對(duì)表達(dá)有ChR2/eNpHR3.0的谷氨酸能神經(jīng)元給予藍(lán)光/黃光光刺激，觀察到足夠產(chǎn)生（ChR2）或抑制（eNpHR3.0）動(dòng)作電位產(chǎn)生的光電流。免疫組化的結(jié)果顯示由ChR2/eNpHR3.0-YFP融合蛋白表達(dá)所產(chǎn)生的熒

7、光可與興奮性神經(jīng)元標(biāo)志抗體CamKαⅡ的熒光完全重疊，而不與抑制性神經(jīng)元標(biāo)志抗體GAD67的熒光重疊，提示在CamKαⅡ啟動(dòng)子控制下，慢病毒載可將光敏基因特異性的表達(dá)于谷氨酸能神經(jīng)元。在體實(shí)驗(yàn)研究中，我們對(duì)表達(dá)有eNpHR3.0的自發(fā)高血壓大鼠給予593.5nm波長(zhǎng)的黃光刺激，觀察到平均動(dòng)脈壓下降20mmHg左右，并持續(xù)約20分鐘。
　　結(jié)論：我們成功的搭建了一整套用于研究下丘腦室旁核谷氨酸能神經(jīng)元對(duì)血壓調(diào)節(jié)作用的光遺傳學(xué)平臺(tái)，其