人牙髓側(cè)群細(xì)胞生物學(xué)特性及體外誘導(dǎo)分化研究.pdf

1、2000年Gronthos等首次發(fā)現(xiàn)具有克隆形成能力和多向分化能力的牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)以來(lái)，DPSCs逐漸成為干細(xì)胞領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。然而，牙髓干細(xì)胞的異質(zhì)性以及缺乏特異性表面標(biāo)記已成為DPSCs研究的瓶頸。1996年，Goodell等在用Hoechst33342染色法研究全骨髓時(shí)，發(fā)現(xiàn)有極少一部分細(xì)胞可以將進(jìn)入細(xì)胞核的熒光染料排出胞外，在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)為不著色

2、，他們將這類細(xì)胞命名為側(cè)群細(xì)胞(Side population，SP)。通過(guò)具有355nm紫外激發(fā)裝置的流式細(xì)胞儀就可以將這部分細(xì)胞檢測(cè)或分選出來(lái)。SP表型是由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(ATP-binding cassette transporter superfamily)介導(dǎo)的，其中一個(gè)主要的介導(dǎo)分子為ABCG2(ATP-binding cassette，sub-family G，member2)或BCRP(Breast cancer r

3、esistance protein)。目前SP分選技術(shù)已被大量運(yùn)用于腫瘤干細(xì)胞的分離。研究發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞還存在于多種生物的正常組織，如臍血、骨骼肌、骨、肺、肝、胰腺、表皮細(xì)胞、前腦、睪丸、心臟、腎臟、角膜上皮緣、前列腺、唾液腺、乳腺等。這些SP細(xì)胞大多具有干細(xì)胞特性如自我更新和多向分化能力。還有研究表明豬牙髓細(xì)胞中可以分離得到具有多向分化能力的SP細(xì)胞，人牙髓細(xì)胞，牙周細(xì)胞中也檢測(cè)到少量SP表型。
　　 本研究的目的旨在對(duì)人牙髓細(xì)

4、胞進(jìn)行SP表型鑒定，探討體外缺血培養(yǎng)對(duì)牙髓SP表型的影響。分離培養(yǎng)人牙髓SP細(xì)胞，體外誘導(dǎo)其向成牙本質(zhì)/成骨、成脂、成神經(jīng)、成血管內(nèi)皮方向分化，并檢測(cè)牙髓SP細(xì)胞的生物學(xué)特性，為SP分選應(yīng)用于人牙髓干細(xì)胞的分離和純化奠定基礎(chǔ)。
　　 第一章：人牙髓細(xì)胞體外培養(yǎng)及SP鑒定。
　　 目的：從人健康恒牙及乳牙牙髓組織中分離、培養(yǎng)牙髓細(xì)胞，檢測(cè)第2代DPCs中SP含量，ABCG2的表達(dá)情況，結(jié)合ABCG2在牙髓組織中的定位，分析

5、ABCG2表達(dá)對(duì)維持牙髓SP細(xì)胞表型所起作用。
　　 方法：酶消化法原代培養(yǎng)人恒牙及乳牙牙髓細(xì)胞。Hoechst33342染色后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)恒牙牙髓細(xì)胞和乳牙牙髓細(xì)胞中SP比例。用ABCG2抗體進(jìn)行免疫熒光染色，定位ABCG2在人牙髓細(xì)胞中的表達(dá)。采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞中ABCG2基因表達(dá)水平。免疫組化染色確定ABCG2在正常和炎癥牙髓組織中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：體外培養(yǎng)的恒牙和乳牙牙髓細(xì)胞中均檢測(cè)到S

6、P細(xì)胞，其中恒牙SP比例約占1％，乳牙SP約為2％。免疫熒光結(jié)果顯示ABCG2表達(dá)在牙髓細(xì)胞的胞膜。熒光定量RT-PCR檢測(cè)到兩種牙髓細(xì)胞均有ABCG2基因表達(dá)，其中乳牙牙髓細(xì)胞略高于恒牙牙髓細(xì)胞(p＜0.05)。免疫組化染色顯示ABCG2在正常牙髓中主要表達(dá)于血管周和成牙本質(zhì)細(xì)胞層，而在炎癥牙髓組織中可見(jiàn)ABCG2+細(xì)胞增多。
　　 結(jié)論：人恒牙和乳牙牙髓細(xì)胞中均可檢測(cè)到SP細(xì)胞及其標(biāo)志物ABCG2的表達(dá)，其中乳牙牙髓SP比例

7、稍高。ABCG2在正常牙髓組織定位于血管周和成牙本質(zhì)細(xì)胞層，炎癥牙髓組織中ABCG2表達(dá)增高。
　　 第二章：體外缺血培養(yǎng)對(duì)牙髓SP的影響。
　　 目的：本部分將在體外模擬缺血培養(yǎng)牙髓細(xì)胞，檢測(cè)缺血培養(yǎng)對(duì)牙髓SP表型，SP標(biāo)志ABCG2及干細(xì)胞標(biāo)志Oct4的影響。
　　 方法：確定體外模擬缺血條件(2％O2 and2％FBS)，實(shí)驗(yàn)分三組：正常組，24h缺血組，48h缺血組。MTT法檢測(cè)缺血培養(yǎng)對(duì)牙髓細(xì)胞增殖的影

8、響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)正常組，24h和48h缺血組SP細(xì)胞比例。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中ABCG2與Oct4的蛋白表達(dá)。熒光定量RT-PCR檢測(cè)各組ABCG2和Oct4mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：MTT檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示從5-7天開(kāi)始，缺血組細(xì)胞增殖與正常組相比呈明顯抑制趨勢(shì)(p＜0.05)，尤其是48h缺血組(p＜0.01)。流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件下牙髓細(xì)胞中SP含量明顯不同，缺血組SP比例較正常組增高。其中48h缺血組中SP細(xì)胞

9、的含量約為5％，24h缺血組中含2％SP細(xì)胞，而對(duì)照組中僅有1％。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果提示24h和48h缺血組中ABCG2+、Oct4+細(xì)胞較正常組增多，其中24h缺血組ABCG2+細(xì)胞數(shù)與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，48h缺血組與正常組相比差異更顯著(p＜0.01)，同時(shí)48h缺血組Oct4+細(xì)胞數(shù)與正常組相比差異也較顯著(p＜0.01)。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示48h缺血組ABCG2和Oct4基因表達(dá)水平均明顯高于其

10、余兩組(p＜0.01)。
　　 結(jié)論：短期體外缺血培養(yǎng)可以促進(jìn)人牙髓SP細(xì)胞及其標(biāo)志物ABCG2的表達(dá)。同時(shí)還可提高干細(xì)胞標(biāo)志Oct4的表達(dá)。
　　 第三章：牙髓SP細(xì)胞體外多向分化能力檢測(cè)。
　　 目的：通過(guò)流式分選得到人牙髓SP及MP細(xì)胞，并進(jìn)行體外多向分化(成牙本質(zhì)/成骨，成脂，成神經(jīng)，成血管內(nèi)皮)誘導(dǎo)，觀察牙髓SP細(xì)胞是否具有良好的多向分化潛能。
　　 方法：通過(guò)流式細(xì)胞儀分離獲得牙髓SP和MP細(xì)

11、胞。體外誘導(dǎo)牙髓SP和MP細(xì)胞向成牙本質(zhì)/成骨分化，誘導(dǎo)14d后，茜素紅染色觀察礦化基質(zhì)的形成。熒光定量RT-PCR檢測(cè)成牙本質(zhì)/成骨標(biāo)志基因DSPP，DMP-1的表達(dá)。體外誘導(dǎo)牙髓SP和MP細(xì)胞向成脂分化，培養(yǎng)21d后，油紅O染色。熒光定量RT-PCR檢測(cè)成脂標(biāo)志基因PPARγ2與LPL表達(dá)。體外誘導(dǎo)牙髓SP和MP細(xì)胞神經(jīng)分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)4天后，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)NSE表達(dá)。熒光定量RT-PCR檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志基因NSE和NEF的表達(dá)。

12、體外誘導(dǎo)牙髓SP和MP細(xì)胞向血管內(nèi)皮分化，分化培養(yǎng)7天的細(xì)胞進(jìn)行Matrivgel管狀形成試驗(yàn)，熒光定量RT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志基因vWF，CD31的表達(dá)。
　　 結(jié)果：成牙本質(zhì)/成骨誘導(dǎo)：茜素紅染色顯示SP細(xì)胞誘導(dǎo)兩周后形成的礦化基質(zhì)較MP細(xì)胞多，相關(guān)基因DSPP與DMP-1的表達(dá)量SP細(xì)胞明顯高于MP細(xì)胞(p＜0.01)。成脂誘導(dǎo)分化：油紅O染色顯示SP細(xì)胞誘導(dǎo)三周后形成細(xì)胞內(nèi)脂滴較MP細(xì)胞大且多，相關(guān)基因PPARγ2與

13、LPL的表達(dá)量SP細(xì)胞明顯高于MP細(xì)胞(p＜0.01)。成神經(jīng)誘導(dǎo)分化：誘導(dǎo)2d后SP細(xì)胞發(fā)生極化，細(xì)胞突起形成，誘導(dǎo)4d后免疫熒光染色顯示SP細(xì)胞NSE呈強(qiáng)陽(yáng)性，MP細(xì)胞表達(dá)陰性。成神經(jīng)誘導(dǎo)后相關(guān)基因NSE與NEF的表達(dá)量SP細(xì)胞明顯高于MP細(xì)胞(p＜0.01)。成血管內(nèi)皮誘導(dǎo)分化：誘導(dǎo)7d后SP細(xì)胞在Matrivgel膠上形成二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，MP細(xì)胞未見(jiàn)成管。成血管內(nèi)皮誘導(dǎo)后相關(guān)基因vWF與CD31的表達(dá)量SP細(xì)胞明顯高于MP細(xì)胞(p

14、＜0.01)。
　　 結(jié)論：人牙髓SP細(xì)胞在體外具備成牙本質(zhì)/成骨、成脂、成神經(jīng)和成內(nèi)皮的多向分化潛能，有望成為組織工程新的種子細(xì)胞。
　　 第四章：人牙髓SP細(xì)胞生物學(xué)特性研究。
　　 目的：為進(jìn)一步證實(shí)人牙髓SP細(xì)胞的干細(xì)胞特性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離得到的SP和MP細(xì)胞進(jìn)行了相關(guān)的生物學(xué)特性檢測(cè)，包括克隆形成實(shí)驗(yàn)、干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)以及SP細(xì)胞長(zhǎng)期分化實(shí)驗(yàn)。
　　 方法：通過(guò)流式細(xì)胞儀分離獲得牙髓SP和M

15、P細(xì)胞?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)檢測(cè)牙髓SP和MP細(xì)胞克隆形成能力。熒光定量RT-PCR檢測(cè)七個(gè)干細(xì)胞相關(guān)基因在SP和MP細(xì)胞表達(dá)水平。收集分選后傳至第三代，第六代和第九代的SP細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀和Western Blot檢測(cè)ABCG2蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)ABCG2基因表達(dá)。
　　 結(jié)果：SP細(xì)胞的集落形成率(5.3士0.8)％，明顯高于MP細(xì)胞(0.6士0.2)％(p＜0.01)。熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示7個(gè)干

16、細(xì)胞相關(guān)基因Tert，SDF-1，α-SMA，Oct4，Bmil，CD146和Stat3在人牙髓SP細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MP細(xì)胞。流式細(xì)胞儀對(duì)第三代，第六代和第九代人牙髓SP細(xì)胞表面ABCG2表達(dá)分析，結(jié)果顯示隨傳代次數(shù)增加細(xì)胞表面ABCG2蛋白表達(dá)量逐漸減少。Western blot結(jié)果也證實(shí)ABCG2蛋白在SP細(xì)胞傳代過(guò)程中各時(shí)相表達(dá)有差異。熒光定量PCR結(jié)果表明各代SP細(xì)胞ABCG2mRNA變化趨勢(shì)與ABCG2蛋白基本一致。