核苷酸剪切修復基因單核苷酸多態(tài)性與胃癌遺傳易感性的分子流行病學研究.pdf

1、背景與目的:胃癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，世界范圍內(nèi)胃癌的新發(fā)病人數(shù)約為99.0萬人，僅次于肺癌、乳腺癌與結(jié)直腸癌;死亡人數(shù)約為73.4萬人，僅次于肺癌。胃癌的發(fā)生是多因素參與、多基因變異及多階段逐步發(fā)生的過程。除環(huán)境因素外，基因組DNA的穩(wěn)定性在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。DNA損傷修復能力的強弱是維持基因組DNA穩(wěn)定性以及細胞正常功能的重要環(huán)節(jié)，一旦修復基因發(fā)生改變（體突變以及遺傳多態(tài)性變化），就會對整個基因組DNA的修復能力產(chǎn)

2、生影響，當機體不能夠及時修復損傷的DNA，以致?lián)p傷積累到一定程度就會導致基因組DNA不穩(wěn)定性大大提高，從而引起細胞增殖和分化異常，最終導致腫瘤的發(fā)生。中國胃癌的發(fā)病率以及死亡率遠高于國外，但與其病因有關(guān)的核苷酸剪切修復(NER)通路核心基因的研究相對不足，已有的研究主要集中于引起氨基酸改變的個別位點的研究，而對于功能性位點的研究甚少;再者，已發(fā)表研究中的樣本數(shù)量少且單個研究中所包括的病人及對照的數(shù)目也相對較小，缺乏系統(tǒng)性的基于整個NER

3、通路的大樣本的研究。因此，本研究采用大樣本旨在探討NER通路核心基因潛在功能性位點單核苷酸多態(tài)性與胃癌的遺傳易感性的關(guān)系，為胃癌的早期診斷和治療提供科學依據(jù)。
　　方法:我們對NER通路核心基因16個潛在功能性位點在1125例胃癌病人及1196例健康對照中運用TaqMan探針法進行基因分型，利用HapMap數(shù)據(jù)庫中270個正常人的基因型數(shù)據(jù)以及相應(yīng)的mRNA表達數(shù)據(jù)對所發(fā)現(xiàn)陽性位點進行基于基因型的mRNA表達分析，并對基因3'端陽

4、性位點構(gòu)建雙熒光報告質(zhì)粒與miRNA共轉(zhuǎn)染進行細胞水平的功能分析。采用卡方檢驗比較人口學特征、吸煙及飲酒狀況、腫瘤部位、腫瘤分期以及NER通路核心基因各基因型在病例及對照中的分布差異;應(yīng)用單因素和多因素logistic回歸分析計算比值比(OR)及95％置信區(qū)間(CI)及獨立樣本t檢驗計算不同基因型的mRNA表達差異及熒光素酶活力差異;我們還采用異質(zhì)性檢驗計算樣本是否存在取樣偏倚及假陽性報道預(yù)測評估結(jié)果的假陽性率并采用多因子降維法分析交互

5、作用等方法對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:我們所得到的結(jié)果如下:
　　1、所選ERCC1基因3個多態(tài)性位點單個位點分析表明rs2298881C＞A以及rs11615G＞A多態(tài)性位點在病例組及對照組中存在著顯著的統(tǒng)計學差異（P值分別為0.037及0.0496）。多因素Logistic回歸分析顯示，與攜帶rs2298881AA基因型的個體相比，rs2298881AC基因型攜帶者個體患病風險增加了37％(校正OR=1.37，9

6、5％ CI=1.08-1.74); rs2298881CC基因型攜帶者個體患病風險增加了26％（校正OR=1.26，95％ CI=0.98-1.63）;rs2298881AC/CC基因型攜帶者個體患病風險增加了33％（校正OR=1.33，95％ CI=1.05-1.67）。而與攜帶rs11615GG基因型的個體相比，rs11615AG基因型攜帶者個體患病風險增加了25％(校正OR=1.25，95％ CI=1.05-1.48); rs11

7、615AA基因型攜帶者個體患病風險增加了13％（校正OR=1.13，95％ CI=0.78-1.63）;rs11615AG/AA基因型攜帶者個體患病風險增加了23％（校正OR=1.23，95％ CI=1.05-1.46）。在與擁有0-1個ERCC1基因雙倍型者相比，擁有2-3個危險雙倍型的個體患病風險增加了56％(校正OR=1.56,95％ CI=1.27-1.93)。
　　進一步分層分析顯示，對于rs2298881AA基因型來說

8、，rs2298881AC/CC基因型者在女性、現(xiàn)吸煙者、不飲酒者、非賁門腺癌患者及早期患者中具有更顯著的危險性。對于rs11615GG基因型來說，rs2298881AG/AA基因型者在年輕者、女性、現(xiàn)吸煙者、飲酒者、非賁門腺癌患者及早期患者中具有更顯著的危險性。而對于擁有0-1個危險雙倍型個體來說，2-3個危險雙倍型者在年長者、女性、現(xiàn)吸煙者、飲酒者、非賁門腺癌患者及早期患者中具有更顯著的危險性。
　　根據(jù)所選ERCC1所選的3個

9、SNP位點進行聯(lián)合分析，與最常見的CCG單倍型相比，ACG單倍型在胃癌患者中明顯少于正常對照(校正OR=0.72,95％ CI=0.61-0.86)。這與前面rs2298881C＞A在病例及對照中的風險是一致的。
　　我們對前面發(fā)現(xiàn)的陽性結(jié)果進行假陽性報道預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在設(shè)定假陽性報道預(yù)測值為0.2，先驗概率為0.01條件下，與擁有0-1個危險雙倍型個體相比，2-3個危險雙倍型的陽性結(jié)果仍然可信（FPRP值=0.007）。在該分層分析

10、下非飲酒者，胃非賁門腺癌以及早期患者的陽性結(jié)果可信。此外，與最常見的CCG單倍型相比，發(fā)現(xiàn)的ACG在胃癌患者中明顯低于正常對照也是可信的。
　　在中國人群中，相對于rs2298881AA基因型攜帶者來說，rs2298881CC基因型攜帶者ERCC1基因的mRNA表達量明顯升高(P=0.006)，rs2298881AC/CC基因型攜帶者的mRNA表達量也是明顯升高的（P=0.006），且從AA-AC-CC有明顯的累積效應(yīng)（Ptren

11、d=0.003）。對于含有四種人的總?cè)巳簛碚f，rs2298881CC基因型攜帶者mRNA表達量也是明顯升高(P=0.001)，rs2298881AC/CC基因型攜帶者的mRNA表達量也是明顯升高的(P=0.004)，且從AA-AC-CC有明顯的累積效應(yīng)（Ptrend＜0.0001）。而對于rs11615多態(tài)性位點，在中國人群以及總?cè)巳褐形窗l(fā)現(xiàn)突變型AA相對于野生型GG有顯著的表達量的改變。
　　2、所選XPC基因2個SNP位點單個

12、位點分析表明，僅rs1870134G＞C在病例組及對照組中存在著顯著的統(tǒng)計學差異（P值為0.009）。多因素Logistic回歸分析顯示，與攜帶rs1870134GG基因型的個體相比，rs1870134CG基因型攜帶者個體患病風險降低了20％（校正OR=0.80，95％ CI=0.68-0.95）;rs1870134CC基因型攜帶者個體患病風險降低了30％（校正OR=0.70，95％ CI=0.50-0.97）;rs1870134CG/

13、CC基因型攜帶者個體患病風險降低了21％(校正OR=0.79，95％CI=0.67-0.93)。在與擁有0-1個XPC基因危險雙倍型者相比，擁有2個危險雙倍型的個體患病風險降低了21％（校正OR=0.79，95％ CI=0.67-0.93）。
　　進一步分層分析表明，對于rs2228001GG基因型來說，rs2228001TG/TT基因型者在飲酒者、非賁門腺癌患者中具有顯著的保護作用。對于rs1870134GG基因型來說，rs18

14、70134CG/CC基因型者在年輕者、男性、非吸煙者、非飲酒者、非賁門腺癌患者及中晚期患者中具有更顯著的保護作用。而與擁有0-1個危險雙倍型個體相比，擁有2個危險雙倍型者結(jié)果與rs1870134者類似。
　　根據(jù)所選XPC基因的2個SNP位點進行聯(lián)合分析，與最常見的TG單倍型相比，GG單倍型在胃癌患者中明顯多于正常對照，其胃癌發(fā)病風險增加了15％（校正OR=1.15，95％CI=1.00-1.33）。
　　我們對XPC基因所

15、發(fā)現(xiàn)的陽性結(jié)果進行假陽性報道預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在設(shè)定假陽性報道預(yù)測值為0.2，先驗概率為0.01條件下，在分層分析中與GG基因型攜帶者個體相比，CG/CC基因型攜帶者在年青者，胃非賁門腺癌以及中晚期患者的陽性結(jié)果可信。在分層分析中與擁有0-1個危險雙倍型個體相比，2個危險雙倍型的陽性結(jié)果在年輕者，胃非賁門腺癌以及早期患者的陽性結(jié)果可信。
　　針對XPC基因的陽性位點rs1870134進行基于基因型的mRNA表達分析，發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中r

16、s1870134CC基因型攜帶者XPC基因mRNA表達水平明顯低于rs1870134GG基因型攜帶者(P=0.026)。在含有所有人的人群中，當rs1870134GG基因型攜帶者mRNA表達量作為對照時，rs1870134CG基因型攜帶者mRNA表達量顯著降低(P=0.0002);rs1870134CC基因型攜帶者mRNA表達量亦顯著降低(P=0.010);rs1870134CG/CC基因型攜帶者mRNA表達量也明顯降低(P＜0.000

17、1)。
　　3、所選XPD基因4個SNP位點的多態(tài)性與胃癌發(fā)病風險均無顯著性關(guān)聯(lián)。
　　4、所選XPF基因2個SNP位點在病例組及對照組比較中均無顯著的統(tǒng)計學差異。然而，與最常見的CA單倍型相比，GA單倍型攜帶者胃癌發(fā)病風險增加了19％（校正OR=1.19，95％CI=1.01-1.40）。
　　5、所選XPG基因5個SNP位點單個位點分析表明，在所選五個SNP位點中僅rs873601G＞A在病例組及對照組中存在著顯著

18、的統(tǒng)計學差異，尤其是在隱性遺傳模型下（P值為0.032）。多因素Logistic回歸分析顯示，rs873601G＞A的位點變異與胃癌的發(fā)病風險呈正相關(guān)。與攜帶rs873601GG基因型的個體相比，rs873601AG基因型攜帶者個體患病風險增加了8％(校正OR=1.08，95％ CI=0.89-1.32); rs873601AA基因型攜帶者個體患病風險增加了30％(校正OR=1.30，95％ CI=1.03-1.64);在隱性模型下與r

19、s873601GG/AG基因型攜帶者相比，rs873601AA基因型攜帶者個體患病風險增加了23％(校正OR=1.23，95％CI=1.01-1.49)。在與擁有0-2個XPG基因危險雙倍型者相比，擁有3-4個危險雙倍型的個體患病風險增加了25％（校正OR=1.25，95％ CI=1.04-1.51）。
　　進一步分層分析表明，當rs873601GG/AG作為對照基因型時，rs873601AA基因型者在年長組、男性、吸煙者、非賁門

20、腺癌患者及早期患者中具有顯著的危險作用。
　　假陽性報道預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，在設(shè)定假陽性報道預(yù)測值為0.2，先驗概率為0.1條件下，與rs873601GG基因型攜帶者相比，rs873601AA基因型可提高胃癌發(fā)病風險仍然可信（FPRP值=0.159）;在隱性模型下，僅年長組陽性結(jié)果仍然可信。在0-2個危險雙倍型為對照下，擁有3-4個危險雙倍型的陽性結(jié)果可信;對其進行分層分析時男性、胃非賁門腺癌以及早期患者的陽性結(jié)果可信。
　　我們

21、還針對XPG基因的陽性位點rs873601進行基于基因型的mRNA表達分析，發(fā)現(xiàn)當rs873601GG基因型攜帶者mRNA表達量作為對照時，在中國漢族人群中rs873601AA基因型攜帶者XPG基因mRNA表達水平明顯降低(P=0.011)。在其它三種人群中該現(xiàn)象不明顯，而在含有所有人的人群中，rs873601AA基因型攜帶者mRNA表達量也是顯著降低(P=0.002);rs873601AG/AA基因型攜帶者mRNA表達量亦顯著降低（P

22、=0.029）。在對所選的141例胃癌癌旁正常組織mRNA進行檢測發(fā)現(xiàn)rs873601AA與rs873601GG基因型攜帶者mRNA表達存在一定的差異(P=0.096)，但尚未達到顯著性。
　　將含有psiCHECK2∶rs873601AA、psiCHECK2∶rs873601GG及陰性對照的質(zhì)粒與has-miR-1227進行轉(zhuǎn)染，rs873601GG基因型的熒光素酶活力明顯低于rs873601AA基因型者，在所有四株細胞中均差異

23、明顯:HeLa細胞株(P=4.85×10-6)，A549細胞株（P=0.002），N45細胞株(P=0.007)及7901細胞株(3.98×10-4)。
　　我們對所發(fā)現(xiàn)的4個有意義位點進行類似于單倍型的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)與具有保護作用的AGCG單倍型攜帶者相比，AGCA單倍型攜帶者在胃癌患者中明顯多于正常對照，其胃癌發(fā)病風險增加了40％(校正OR=1.40，95％ CI=1.02-1.93); AGGG單倍型攜帶者其胃癌發(fā)病風險增加

24、了38％(校正OR=1.38，95％ CI=1.10-1.72); CGGA單倍型攜帶者其胃癌發(fā)病風險也增加了38％(校正OR=1.38，95％ CI=1.10-1.72); CAGA單倍型攜帶者其胃癌發(fā)病風險增加了53％(校正OR=1.53，95％CI=1.22-1.92)。
　　我們采用多因子降維法對所發(fā)現(xiàn)的四個有意義位點以及與之相關(guān)的在病人及正常對照中均存在的可能危險因素進行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)在單一因素下吸煙狀態(tài)對胃癌的發(fā)生發(fā)揮

25、著重要的作用，其符核效度為100/100，平均預(yù)測錯誤為45.2％;在三個因素下吸煙、年齡以及rs1870134G＞C多態(tài)性為最佳交互作用模型，其符核效度為100/100，平均預(yù)測錯誤為42.9％;而將所有因素以及基因型結(jié)合起來時其符核效度為100/100，平均預(yù)測錯誤為39.0％。
　　結(jié)論:NER通路ERCC1基因rs2298881C＞A、rs11615G＞A，XPC基因rs1870134G＞C以及XPG基因rs873601G