促CD4+CD25-naiveT細(xì)胞Treg化重組蛋白的表達(dá)、純化、復(fù)性及功能鑒定.pdf

1、目的:構(gòu)建體外促CD4+CD25-na(i)ve T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Foxp3+regular T細(xì)胞(Treg)的重組蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-C2-C4-L-hmTGF-β1,誘導(dǎo)表達(dá)、純化及體外復(fù)性蛋白Pc2-C4-L-hmTGF-β1(簡(jiǎn)稱pCLT),并鑒定復(fù)性后蛋白功能。
　　 方法:
　　 1.表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)條件的優(yōu)化:分別雙酶切已鑒定正確質(zhì)粒Pcr2.1-C2-C4-linker和Pc

2、r2.1-hmTGF-β1,回收目的片段C2-C4-linker和hmTGF-β1,通過(guò)T4連接酶定向連接hmTGF-β1和線性化原核表達(dá)載體pET28a,連接三片段C2-C4-linker、hmTGF-β1和pET28a,獲得重組蛋白Pclt原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-C2-C4-L-hmTGF-β1。構(gòu)建正確質(zhì)粒pET28a-C2-C4-L-hmTGF-β1轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3),誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)蛋白Pclt表達(dá),

3、Bandsean軟件分析蛋白表達(dá)量,western blot鑒定所表達(dá)蛋白及表達(dá)形式,通過(guò)探索誘導(dǎo)劑IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　 2.蛋白的純化及復(fù)性:包涵體洗滌及鎳親和層析法純化目的蛋白,通過(guò)梯度濃度咪唑洗脫建立蛋白純化條件,Bandscan軟件分析純化效果。透析復(fù)性方式復(fù)性純化后蛋白pCLT,建立尿素梯度透析復(fù)性蛋白,通過(guò)改變復(fù)性液組分和復(fù)性前蛋白濃度,摸索蛋白復(fù)性最佳條件。
　　 3.體外蛋白質(zhì)

4、和功能鑒定:通過(guò)檢測(cè)蛋白對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖的影響和免疫共沉淀法鑒定復(fù)性后蛋白的活性。復(fù)性后蛋白與人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113和人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Hut78及Jurkat E6-1共培養(yǎng),通過(guò)MTT法測(cè)共培養(yǎng)后細(xì)胞增增殖的情況,分析不同蛋白濃度和不同時(shí)間,蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響,分析復(fù)性后重組蛋白pCLT與hmTGF-β1抑制細(xì)胞增殖的差異。
　　 結(jié)果:
　　 ①酶切鑒定結(jié)果與測(cè)序結(jié)果與理論值相符,成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒p

5、ET28a-C2-C4-L-hmTGF-β1。IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá),SDS-PAGE電泳分析,分別在約33kD處出現(xiàn)了一條新的蛋白條帶,主要以包涵體形式獲得表達(dá),western blot結(jié)果顯示該條帶能夠與His抗體特異性結(jié)合;在誘導(dǎo)劑IPTG濃度為O.1mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)6h后,蛋白pCLT達(dá)到最大表達(dá)量,所表達(dá)蛋白占菌體總蛋白量40％左右。
　　 ②鎳親和層析純化目的蛋白,純度達(dá)90％以上。透析復(fù)性法探索得到蛋白復(fù)性最佳

6、條件。
　　 ③免疫共沉淀檢測(cè)復(fù)性后重組蛋白pCLT可與Hut78及Jurkat E6-1細(xì)胞表面CD4分子結(jié)合,復(fù)性后蛋白pCLT對(duì)照分子hmTGF-β1均可抑制細(xì)胞Tca8113的增殖,并存在一定的量-效和時(shí)-效關(guān)系;重組蛋白pCLT較對(duì)照分子hmTGF-β1對(duì)CD4+Jurkat E6-1細(xì)胞表現(xiàn)出較高的抑制率。
　　 結(jié)論:
　　 ①成功構(gòu)建促Treg化重組分子原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-C2-C4-L-h