流式微球分析技術(shù)檢測人心肌鈣蛋白T方法的建立.pdf

1、目的:建立流式微球分析(cytometric bead assay，CBA)技術(shù)檢測人心肌鈣蛋白T(cTnT)方法。
　　方法:用鼠抗人的cTnT的單克隆抗體包被在已激活的羧基化聚苯乙烯微球上，用封閉液封閉微球上未結(jié)合單抗的位點，然后再用包被好的微球與檢測標本進行抗原抗體免疫反應(yīng)，并加入羊抗人cTnT的多克隆抗體和異硫氰酸熒光素(FITC)標記的驢抗羊的多克隆抗體，室溫避光免疫反應(yīng)一定時間，洗滌后，上流式細胞儀檢測FITC的熒光強

2、度，以此測定標本中cTnT含量。通過加入不同含量的鼠抗人cTnT單克隆抗體與已激活的微球進行偶聯(lián)，再與過量FITC標記羊抗鼠IgG反應(yīng)，根據(jù)檢測到的熒光強度，選擇適當?shù)氖罂谷薱TnT單克隆抗體加入量;加入標本和抗體后，通過免疫反應(yīng)不同的時間，選擇最適免疫反應(yīng)時間;加入標本和抗體免疫反應(yīng)后，通過洗滌不同的次數(shù)，選擇適當?shù)南礈齑螖?shù);通過加入不同濃度的羊抗人cTnT多克隆抗體與一定量的cTnT標準品、一定量的偶聯(lián)微球和過量的FITC標記驢抗羊

3、IgG免疫反應(yīng)，根據(jù)檢測到的熒光強度，選擇適當?shù)难蚩谷薱TnT多克隆抗體工作濃度;通過加入不同濃度的FITC標記驢抗羊IgG與一定量羊抗人cTnT多克隆抗體、一定量的cTnT標準品、一定量的偶聯(lián)微球免疫反應(yīng)，根據(jù)檢測到的熒光強度，選擇適當?shù)腇ITC標記驢抗羊IgG為最佳工作濃度。在各種抗體加入量和免疫反應(yīng)最佳條件下，對本法進行方法學評價。
　　結(jié)果:通過實驗摸索，選擇每1.25×106個微球加入10μg的鼠抗人cTnT單克隆抗體為

4、最佳加入量;加入標本和抗體后，選擇避光免疫反應(yīng)120min，洗滌一次，上流式細胞儀檢測;選擇8μg/ml羊抗人cTnT多克隆抗體為最佳工作濃度;選擇20μg/ml FITC標記驢抗羊IgG為最佳工作濃度。在各種抗體加入量和免疫反應(yīng)最佳條件下，本方法的檢測靈敏度為16.0pg/mL，線性范圍是80-5000 pg/mL，批內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)為5.2-11.3％，回收率是94.7-11.5％，高濃度的甘油三脂、膽固醇和膽紅素的干擾率分別為7.