云南紅豆杉枝葉中抗癌活性成分的提取工藝與黃酮類(lèi)化合物的研究.pdf

1、腫瘤是危害人類(lèi)生命的疾病，死亡率僅次于心血管疾病，居各類(lèi)疾病死亡率的第二位。長(zhǎng)期以來(lái)，尋找抗癌生物資源與天然藥物成為各國(guó)醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)及生物學(xué)家的一個(gè)共同愿望。近年來(lái)，從天然藥中提取的抗腫瘤有效成分日益得到人們的重視。天然植物紅豆杉中作為廣譜抗癌的一天然資源，為越來(lái)越多腫瘤患者的醫(yī)治帶來(lái)福音。但由于這一天然資源的匱乏，植物中有效含量極低，現(xiàn)有提取工藝和制劑使用過(guò)程還存在諸多問(wèn)題，故有必要對(duì)存在的問(wèn)題進(jìn)行改善及解決。 本文的主要

2、目的就是希望綜合利用紅豆杉中的抗癌活性物，使其生產(chǎn)工藝更符合工業(yè)化生產(chǎn)，在操作中有更好的可行性，更能體現(xiàn)生產(chǎn)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、安全等要求；本文同時(shí)還對(duì)紅豆杉中的黃酮類(lèi)化合物還進(jìn)行了總黃酮富集工藝和細(xì)胞藥理實(shí)驗(yàn)的初步研究，并對(duì)含量測(cè)定的方法學(xué)進(jìn)行了考察，有利于紅豆杉中黃酮化合物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。 本論文包括六部分內(nèi)容，其研究方法、結(jié)果如下： 1、綜述 以計(jì)算機(jī)檢索、手工追溯檢索等手段相結(jié)合對(duì)國(guó)、內(nèi)外有關(guān)紅豆杉研究文獻(xiàn)

3、進(jìn)行分類(lèi)綜述，對(duì)目前國(guó)、內(nèi)外紅豆杉的主要研究概況加以合理分析，提出課題研究的方向、意義。2、云南紅豆杉中抗癌活性物制備工藝研究方法：利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)L9(3<'4>)確定原料藥提取工藝為：10倍量90％乙醇提取兩次，第一次40分鐘，第二次30分鐘；醇提液用10倍量水沉；沉淀加6倍量石油醚40℃脫脂；用1mol/L 的NaOH溶液堿洗，除去酸性雜質(zhì)；以堿性氧化鋁柱，以環(huán)己烷/丙酮為洗脫溶劑，在環(huán)己烷-丙酮(6：4)段富集到所需活性部位，洗

4、脫劑用量為3VB。 結(jié)果：富集的有效部位各抗癌成分的含量分別為：紫杉醇：9.45％、三尖杉寧堿：9.63％、10-脫乙酰-巴卡亭III：22.64％、總黃酮：19.15％。 3、金松雙黃酮對(duì)照品的制備方法：取干燥銀杏葉以95％乙醇超聲提取 3 次，提取液合并，減壓濃縮，石油醚脫脂后，用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮，經(jīng)硅膠柱(6cm×80cm)層析，石油醚-乙酸乙酯(9：1～5：5)梯度洗脫，產(chǎn)物用甲醇多次沖淋，再以二甲基

5、甲酰氨溶解，反復(fù)重結(jié)晶，得黃色粉末結(jié)晶。 結(jié)果：(1)HPLC檢測(cè)含量大于95％，符合對(duì)照品的要求；(2)理化鑒別實(shí)驗(yàn)均與文獻(xiàn)吻合；(3)紫外、紅外、質(zhì)譜、核磁共振的光譜結(jié)果均與文獻(xiàn)值一致，確定產(chǎn)物為金松雙黃酮。 4．云南紅豆杉枝葉中總黃酮和金松雙黃酮的測(cè)定及方法學(xué)考察方法：利用高效液相(HPLC)和紫外分光光度法，分別測(cè)定云南紅豆杉枝葉中總黃酮和金松雙黃酮的含量。 結(jié)果：在波長(zhǎng)272nm處測(cè)定，云南紅豆杉枝葉中

6、總黃酮的線性范圍為12～28μg/ml，范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9992)，平均加樣回收率96.04％(RSD為2.7％)，總黃酮的平均含量5.01％；金松雙黃酮的線型范圍為：0.88～4.4μg/ml，進(jìn)樣量與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系(r=0.9999)；平均回收率為95.4％(RSD為3.5％)，平均含量為0.147％(RSD為2.86％)。 5．云南紅豆杉中總黃酮富集工藝的研究方法：(1)確立用超聲法初提藥粉；(2)

7、用L9(3<'4>)正交試驗(yàn)考察脫脂和醇提的工藝參數(shù)；(3)用大孔樹(shù)脂研究總黃酮的富集工藝：考查樹(shù)脂類(lèi)型、上樣液濃度、洗脫曲線等。 結(jié)果：優(yōu)化工藝為：以超聲的方法，15倍量石油醚脫脂30min，重復(fù)3次；再用6倍量80％乙醇提取，第一次提取2h，第二次提取1.5小時(shí)。選用AB-8型大孔樹(shù)脂，上樣濃度為6mg/ml，濕法裝柱，先用水洗脫，水的用量定為1.5～2BV；再用20％乙醇洗脫，用量為1.5～2BV；最后用40％乙醇洗脫，用

8、量為1.5～2BV?？傸S酮的含量為51.26％。 6．總黃酮和金松雙黃酮藥理活性的初步研究方法：取金松雙黃酮、總黃酮提取物，總提取物，依次編為藥物1、2、3號(hào)并以少量二甲基亞砜(DMSO)溶解，加生理鹽水稀釋至規(guī)定濃度，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌后，4℃保存。用MTT 法研究各藥物分別對(duì)肝癌HePG2細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞、白血病K562細(xì)胞增殖的影響。將藥物配成50、100、150(μg/孔)濃度的溶液。根據(jù)測(cè)定的吸收度，

9、計(jì)算不同濃度藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，以抑制率為縱坐標(biāo)，給藥濃度為橫坐標(biāo)繪制抑制率曲線。 結(jié)果：各藥物在不同濃度對(duì)細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制能力：藥物2)藥物1)藥物3；各藥物在中、高濃度時(shí)對(duì)白血病細(xì)胞K562的抑制率均大于50％。 本文結(jié)論：通過(guò)研究，確定了云南紅豆杉枝葉中抗癌活性物的提取工藝，所用方法簡(jiǎn)便、價(jià)廉、環(huán)保，為進(jìn)一步藥理、制劑工作的開(kāi)展打好了工藝基礎(chǔ)；對(duì)云南紅豆杉枝葉中黃酮類(lèi)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，包括