家禽及其暴露人群甲型流感病毒感染的流行病學調查研究.pdf

1、人感染禽流感病毒(avian influenza viruses，AIVs)的事件近年來報道愈加頻繁。自從禽流感病毒H5N1于1997年被報道能夠感染并致人死亡以來，已在15個國家造成658人感染，病死率近60％;禽流感病毒H7N7也于2003年在荷蘭引起1人死亡;其他禽流感病毒如H9N2、H7N3等感染人事件在香港、加拿大等地也有報道。2013年初，禽流感病毒H7N9人感染病例又在我國東南部出現，截止2014年2月28日H7N9已經造

2、成375人感染，115人死亡。因此，我國禽間AIVs感染及人群AIVs感染狀況是備受關注的科學問題。
　　進行H7N9禽流感病毒的現場調查，檢測方法是關鍵一環(huán)。為了選擇能夠應用于現場H7N9禽流感病毒的快速、高效的檢測方法，我們對5種用于檢測人甲型流感感染的商品化試劑盒（Life Technologies VetMAXTM-Gold SIV DetectionKit、Quidel Molecular Influenza A+B a

3、ssay、 Remel Xpect Flu A&B assay、 QuidelQuickvue influenza assay以及Quidel Sofia Influenza A+B assay)進行了評價。首先從江蘇省無錫市和南京市采集的健康活禽肛拭子樣本提取RNA，用世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦的實時熒光定量PCR(qReal-timePCR，qRT-PCR) influenza A

4、 assay和H7N9 assay進行甲型流感病毒和禽流感病毒H7N9檢測，篩選出27個H7N9陽性標本、70個H7N9及甲型流感陰性標本。然后對這97個標本使用上述5種試劑盒進行盲法檢測以及WHO qRT-PCR H7N9assay的復核。檢測時，根據試劑盒的不同試驗原理，核酸分子檢測方法每種重復3次，抗原檢測方法每種重復2次。最后以WHO qRT-PCR H7N9 assay作金標準，計算這幾種方法的敏感度和特異度及其可信區(qū)間(co

5、nfidence interval，CI)。結果:(1)WHO qRT-PCR H7N9 assay第一輪和第二輪結果有很好的一致性。(2)Quidel Quickvue influenza assay對97份標本檢測結果全部顯示陰性。其他四種試驗方法均有很好的特異度(96-100％)。(3) Life Technologies VetMAXTM-GoldSIV Detection Kit特異度最高，為100％(95％ CI0.87-1

6、.00)，假陽性率4％(95％CI1-12％)。Quidel Molecular InfluenzaA+B assay敏感度較高，達85％(95％ CI66-96％)，假陽性率3％(95％ CI0-10％)。
　　為掌握AIVs在無錫地區(qū)家禽中的感染狀況及其遺傳進化特征，我們于2013年7月-12月每月在無錫市活禽交易市場和家禽養(yǎng)殖場的家禽中采集活禽及其相關環(huán)境拭子標本，以拭子標本提取的RNA為模板，運用WHO qRT-PCR i

7、nfluenzaA assay對樣品進行甲型流感病毒篩查，對篩查陽性標本采用一步法反轉錄PCR進行流感病毒全基因組PCR擴增以及基因克隆和測序。測序所得的序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析，同時對甲型流感病毒陽性標本進行MDCK細胞及雞胚分離培養(yǎng)和鑒定。結果:(1)共采集標本305份，甲型流感病毒陽性率為28.5％(87/305)。家禽交易市場樣本甲型流感病毒陽性率高于養(yǎng)殖場(31.9％ vs.10.4％，x2=9.16，P=0.002);(2)共有

8、6個樣本可進行分型，分別為H9N2（3個），H5N8（1個），H11N2（1個）和H5N1（1個）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明H5N8和H11N2有不同程度的重組。(3)共分離到3株禽流感病毒:A/Chicken/1/Wuxi/2013(H9N2)、A/Chicken/2/Wuxi/2013(H9N2)和A/Chicken/1/Wuxi/2013(H5N1)。
　　禽間AIVs感染情況復雜多樣，而禽類飼養(yǎng)、加工等職業(yè)暴露人群是感染AIVs的

9、高危人群。除了感染AIVs發(fā)病甚至死亡之外，他們當中還存在諸如H5、H7、H9、H11等亞型AIVs的隱性感染者。豬能夠感染豬流感病毒(swine influenzavirus，SIV)，也能感染多種禽源和人源流感病毒，在“禽-豬-人”的種間傳播鏈中扮演著流感病毒中間宿主及多重宿主的作用。研究已證明豬可感染禽流感病毒H5N1和H9N2。廣東、福建、浙江地區(qū)約1％的豬職業(yè)暴露人群中有H9N2感染。因此，為了解禽和豬職業(yè)暴露人群甲型流感病毒

10、的感染狀況，通過分析感染與一般人口社會學情況和流行病學特征的關系，確定感染AIVs的危險因素，為人感染AIVs的防治策略提供依據，我們在無錫地區(qū)禽（豬）養(yǎng)殖場、屠宰場、市場和散養(yǎng)戶集中地的暴露人群中開展了甲型流感病毒血清學現況調查。選擇了禽職業(yè)暴露人群498名，豬職業(yè)暴露人群608名和無職業(yè)暴露的對照人群165名，共1271名研究對象。通過血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)試驗和微量中和(micro

11、neutralization，MN)試驗對研究對象血清標本進行了人甲型季節(jié)性流感H1N1(seasonal influenza A/H1N1，sH1N1)、sH3N2，及禽流感病毒H5N1、H9N2和H7N1血清抗體的檢測。結果:(1)禽類職業(yè)暴露、豬職業(yè)暴露和對照人群的sH1N1 HI抗體陽性率分別為17.7％(88/498)，10.9％(66/608)和27.3％(45/165)，三組sH1N1 HI抗體陽性率差異有統(tǒng)計學意義(x2

12、=29.00，df=2，P=0.000)。sH3N2 HI抗體陽性率分別為17.3％(86/498)，6.4％(39/608)和8.5％(14/165)，三組sH3N2 HI抗體陽性率差異有統(tǒng)計學差異（x2=34.29，df=2，P=0.000）。(2) H5N1在禽類職業(yè)暴露人群當中MN滴度≥1∶80和≥1∶160的分別占14.6％和8.4％，在豬職業(yè)暴露人群分別占0.2％和0.2％，對照人群中只有1名(0.6％)對象H5N1MN滴度

13、為1∶80，沒有更高滴度的對象。多因素logistic回歸分析表明，工作場所為市場的禽類職業(yè)暴露人員(OR=57.3，95％ CI7.0-466.5)、慢性呼吸道疾病(OR=12.8，95％ CI1.6-102.5)以及年齡40-60歲(OR=3.1，95％ CI1.5-6.6)為H5N1MN滴度≥1∶80的危險因素。(3)對H5N1MN滴度≥1∶80的76份血清再做HI試驗，最終按WHO MN滴度≥1∶80且HI滴度≥1∶160的確診

14、病例標準判定有3名H5N1感染者，為2名市場賣禽人員和1名規(guī)?；B(yǎng)雞場工人，占禽暴露人群的0.6％(3/498)，這3人中有2人否認近一年內有流感樣癥狀。(4) H9N2試驗結果有5名研究對象MN滴度≥1∶10，其中2名是市場賣禽人員，2名是市場賣豬肉人員，1名是豬屠宰場工人。H9N2在禽職業(yè)暴露人群和豬暴露人群的MN抗體陽性率分別為0.4％(2/498)和0.5％(3/608)。對照人群中未發(fā)現H9N2MN抗體陽性者。(5)H7N1

15、HI試驗結果未發(fā)現抗體滴度≥1∶10者。
　　H7N9禽流感病毒2013年初在中國東南部出現人感染病例，并在短期內呈迅速增長態(tài)勢?；钋菁跋嚓P環(huán)境（包括活禽市場）暴露被認為是感染H7N9的首要危險因素。在H7N9疫情延續(xù)期間，禽暴露人群是否有隱性感染？活禽市場的活禽從業(yè)人員和非活禽從業(yè)人員，以及活禽市場以外的禽類從業(yè)人員相比，感染的風險是否相同？感染與社會人口學、基礎疾病、職業(yè)行為等因素又有什么樣的關系？基于這些科學問題，我們在無錫

16、地區(qū)禽職業(yè)暴露人群中開展了H7N9的血清學現況調查，共納入對象1588名，包括1178名活禽市場從業(yè)人員（300名活禽從業(yè)人員和878名非活禽從業(yè)人員），245名活禽市場以外的活禽從業(yè)人員和165名當地健康居民。實驗方法選擇火雞血HI檢測A/Anhui/1/2013(H7N9)血清抗體，HI滴度≥1∶20的再用MN試驗復核，MN滴度≥1∶20的判為陽性。為考察可能的交叉反應，同時檢測sH1N1、sH3N2以及LPAI H7N1抗體，結果

17、按二分類變量形式納入H7N9感染危險因素的單因素logistic回歸檢驗。結果:(1)HI實驗結果有27份標本(1.7％)HI抗體滴度≥1∶20，再由MN復核，結果有8份標本(0.5％)MN滴度≥1∶20。這8份抗-H7N9中和抗體陽性標本所對應的研究對象分別為無錫7個區(qū)（縣）8個不同活禽市場的從業(yè)人員，其中7名活禽從業(yè)人員，1名為非活禽從業(yè)人員，H7N9抗體陽性率在活禽市場活禽從業(yè)人員中為2.3％(7/300)，在非活禽從業(yè)人員中為0

18、.1％(1/878)。這8名研究對象均否認一年內有流感樣癥狀。(2)所有研究對象禽流感病毒H7N1的HI結果均為陰性。(3)二分類單因素logistic回歸分析顯示，活禽市場活禽從業(yè)人員感染H7N9的風險高于活禽市場非活禽從業(yè)人員(OR=20.95，95％ CI2.57-171.01)。性別之間、不同年齡組之間、不同文化程度和不同收入水平之間抗體陽性率差異無統(tǒng)計學意義。sH1N1、sH3N2感染與H7N9感染也無統(tǒng)計學關聯。
　　

19、結論:(1) Life Technologies VetMAXTM-Gold SIV Detection Kit和QuidelMolecular Influenza A+B assays對活禽肛拭子進行禽流感病毒H7N9檢測的效果與WHO推薦的H7N9 qRT-PCR assay基本一致。(2)江蘇省無錫地區(qū)禽間AIVs感染情況復雜多樣，有H5N1、H5N8、H9N2和H11N2等，H5N8和H11N2很可能是重組毒株。(3)職業(yè)暴露人

20、群AIVs感染普遍，禽暴露人群中存在較高水平的禽流感病毒H5N1感染以及低水平的H7N9和H9N2感染，豬暴露人群中也存在低水平的H5N1和H9N2感染。這些感染者很可能是隱性或輕癥感染。(4)工作場所為市場的禽類職業(yè)暴露人員、慢性呼吸道疾病以及年齡40-60歲為H5N1的感染危險因素。(5)活禽市場的活禽從業(yè)人員感染H7N9的危險高于活禽市場非活禽從業(yè)人員。因此，禽類職業(yè)暴露人群，特別是市場禽類從業(yè)人群，以及有呼吸道慢性疾病禽類暴露人

21、群是AIVs的防控重點人群。加強活禽市場的管理、環(huán)境消毒和人員防護是控制AIVs傳播的必要手段。對禽類和職業(yè)暴露人群AIVs感染狀況進行系統(tǒng)、連續(xù)地監(jiān)測有著重要的公共衛(wèi)生意義。
　　本研究的創(chuàng)新點包括:(1)用HI和MN兩種方法串聯，證實了活禽市場禽暴露人群中存在禽流感病毒H7N9隱性感染，而活禽市場以外禽暴露人群中沒有發(fā)現H7N9隱性感染;(2)在同一禽暴露人群中發(fā)現多種AIVs隱性感染，包括H5N1、H7N9和H9N2感染;(