抗河豚毒素單鏈抗體的制備.pdf

1、河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是一種小分子非蛋白毒素,毒性極強(qiáng),人畜誤食后均能致死。TTX是典型的鈉離子通道抑制劑,中毒者出現(xiàn)肢體麻木、癱瘓等癥狀,嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。TTX人體致死劑量約為0.5mg/70kg。缺乏簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)方法。在本研究中,我們獲得了用于制備TTX檢測(cè)試劑盒的基因工程單鏈抗體,對(duì)TTX進(jìn)行檢測(cè)。
　　 TTX為小分子物質(zhì),分子量?jī)H有319.26,本身只有反應(yīng)原性,不具免疫原性。若直接以其進(jìn)行動(dòng)

2、物免疫,不能產(chǎn)生免疫效果。將TTX與鑰孔假血蘭蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)通過化學(xué)方法連接構(gòu)成具有免疫原性的完全抗原,作為小鼠免疫用抗原;將TTX與牛血清蛋白(Bovine serum albumin,BSA)通過化學(xué)方法連接,作為檢測(cè)用抗原。選取6-8周齡,健康的Balb/c小鼠雌性小鼠作為免疫動(dòng)物進(jìn)行免疫,加強(qiáng)免疫數(shù)次后,測(cè)小鼠血清中anti-TTX抗體效價(jià)。當(dāng)血清效價(jià)達(dá)到一定值后,取效價(jià)最高的

3、小鼠,處死后提取脾臟總RNA。
　　 提取的RNA經(jīng)檢測(cè)后,通過RT-PCR獲得cDNA第一鏈。以上述cDNA為模板,經(jīng)PCR得到抗體重鏈可變區(qū)基因VH和輕鏈可變區(qū)基因VL,以編碼(Gly4Ser)3的核苷酸序列作為linker,通過交錯(cuò)延伸PCR將VH和VL基因組裝為完整的scFv基因。將scFv基因克隆入噬菌體載體pCANTAB-5E中,構(gòu)建了噬菌體單鏈抗體庫(kù)。經(jīng)過6輪淘選,最終從噬菌體抗體庫(kù)中篩選到一株親和力較高的單鏈抗體