載阿倫磷酸鈉PLGA微球的磷酸鈣骨水泥復合組織工程骨修復兔股骨髁骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：骨缺損的治療是骨科醫(yī)生及科研工作者經(jīng)常面臨的難題。創(chuàng)傷、感染和骨腫瘤等致病因素導致的骨缺損難以自身愈合，其引起的功能喪失將影響患者的治療效果和生活質(zhì)量。在骨缺損的臨床治療中，經(jīng)常遇到結構性骨缺損，以及骨折愈合不良、愈合困難甚至不愈合，嚴重時會導致骨不連等。臨床上用于修復骨缺損的替代材料包括自體骨移植、同種異體骨移植和人工骨材料。自體骨移植是目前臨床治療骨缺損的金標準，其是指移植的骨組織在同一個體的體內(nèi)，由一處移向另一處。人體某些部

2、位的骨組織被取出后，基本不會遺留明顯的功能障礙，而這些部位的骨組織往往是自體骨移植的理想供骨。自體骨移植所需的松質(zhì)骨常取自鎖骨或者髂骨，所需的皮質(zhì)骨常取自脛骨或者腓骨。自體骨具有極高的成骨能力和很小的免疫反應，但卻存在增加額外的創(chuàng)傷、來源極為有限、延長手術時間、增加失血量和手術感染的潛在可能性以及持續(xù)的慢性疼痛等缺點，從而限制了其臨床應用。同種異體骨移植是指同種類的一個個體給另一個個體的骨組織移植。移植的骨組織具有不同的遺傳特征，同受體

3、組織會發(fā)生較為嚴重的免疫排斥反應及疾病傳播的潛在危險。其中，由同一結合子發(fā)育而來的兩個個體間的骨組織移植，稱為同基因骨組織移植。在這種情況下，兩個個體的遺傳特征較為接近，可無免疫排斥反應或僅有輕微的排斥反應。同種異體骨移植雖然來源比自體骨移植豐富，但其仍然存在免疫排斥反應、愈合緩慢以及可能導致疾病的傳播與交叉感染等問題。人工骨材料是指一類可對機體骨組織進行修復、替代與再生，具有特殊功能作用的骨組織替代材料。該類人工材料在臨床的應用，為患

4、者較快的恢復正常的生理結構和功能提供了可能，同時也避免了采用自體骨移植和同種異體骨移植所帶來的各種問題。人工骨材料按結構或性質(zhì)可分為無機骨材料、有機骨材料和復合骨材料。人工骨材料可填充骨缺損部位，但不能誘導新生的骨組織生成，人工骨材料的材料學、生物學性能以及降解能力等問題均有待進一步解決。構建復合骨替代材料即組織工程骨成為當今骨缺損治療研究的熱點，將促進骨愈合的藥物與基質(zhì)材料混合后聯(lián)合治療骨缺損是近來研究較多的一種方法。本項研究采用復乳

5、溶劑蒸發(fā)法制備載阿侖膦酸鈉PLGA微球并將其與磷酸鈣骨水泥混合構建構的載阿倫磷酸鈉/磷酸鈣骨水泥復合組織工程骨，首先對其進行載藥量及其釋放規(guī)律、孔徑大小、孔隙率和力學性能等材料學特性的研究;其次通過體外實驗觀察其對兔骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及成骨誘導能力的效果評價其體外生物相容性和成骨性;最后通過構建兔股骨髁骨缺損模型，將載阿倫磷酸鈉/PLGA/磷酸鈣復合組織工程骨植入骨缺損部位，通過影像學和組織學指標評價其體內(nèi)生物相容性和成骨性。本項實驗

6、旨在研究制備搭載阿倫磷酸鈉的PLGA微球與磷酸鈣骨水泥復合后的組織工程骨，評估其體外和體內(nèi)生物相容性和成骨活性，探討其修復兔股骨髁骨缺損的效果及加速修復骨缺損的作用。本項研究有望能為臨床促進骨缺損區(qū)修復提供一種新的治療方法。本項研究分為以下三部分:(1)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC組織工程骨的材料學性質(zhì)研究;(2)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC組織工程骨的體外生物相容性和成骨分化活性的研究;(3)阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC組織工程骨的體

7、內(nèi)生物相容性和促進骨缺損愈合的研究。
　　方法：⑴運用復乳溶劑蒸發(fā)法(W/O/W)制備載阿倫磷酸鈉PLGA微球。采用JSM-6390掃描電鏡觀察微球的微觀形態(tài)，測量其粒徑大小和分布情況;采用酶標儀測定載阿倫磷酸鈉PLGA微球的載藥和緩釋性能。微球與磷酸鈣骨水泥混合制備阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨。采用阿基米德法測定組織工程骨的孔隙率;采用JSM-6390掃描電鏡測量組織工程骨的孔徑大小;采用RGD-5型萬用測試儀測定

8、組織工程骨的力學性能。⑵Percoll密度梯度分離法獲取兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，體外培養(yǎng)純化，倒置顯微鏡觀察其生長狀態(tài)。分別將阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨和單純PLGA/CPC組織工程骨與生長狀況良好的第三代兔骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)，通過掃描電鏡觀察細胞生長形態(tài);采用CCK-8活細胞計數(shù)實驗測定細胞的黏附和增殖;采用流式細胞周期測定材料對于細胞周期的影響;堿性磷酸酶活性和堿性磷酸酶染色評估其對細胞的成骨分化活性。

9、⑶山東大學動物實驗中心提供的45只健康新西蘭成年大白兔(23雌，22雄;體重2.0-3.0kg)，手術建立股骨髁骨缺損的模型，隨機分為A、B、C3組，每組15只。A組為假手術組（單純股骨髁骨缺損組），B組骨缺損后植入PLGA/CPC組織工程骨，C組骨缺損后植入阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨。每只動物均一側(cè)行手術操作。術后6周和12周分批處死動物后取材評估，行大體解剖觀察、X線攝片、Micro-CT掃描分析（骨覆蓋率和骨密度值

10、）和組織學觀察。
　　結果：①復乳溶劑蒸發(fā)法(W/O/W)成功制備出外表圓潤、粒徑200-300μm、粒徑分布均勻的載阿倫磷酸鈉PLGA微球。載阿倫磷酸鈉PLGA微球與單純PLGA微球的外觀、粒徑大小和分布沒有明顯差異。PLGA微球?qū)τ诎惲姿徕c的載藥率為75.12％,可緩慢釋放阿倫磷酸鈉達28天。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合材料孔隙率67.43±4.2％，孔徑213±95μm，抗壓強度達到5.79±1.21Mp，與松質(zhì)骨相

11、當，可基本滿足臨床要求。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合材料與PLGA/CPC材料的孔隙率、孔徑和抗壓強度沒有明顯差異。②載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合材料在體外對骨髓間充質(zhì)干細胞有著良好的體外生物相容性和成骨分化活性。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨與細胞粘附性良好，粘附細胞的形態(tài)正常。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨組的黏附、增殖性顯著增高(P＜0.05)。細胞接種后，載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合

12、組織工程骨組的細胞的分裂增殖速度顯著高于單純PLGA/CPC組織工程骨和空白對照組(P＜0.05)。載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨組的堿性磷酸酶活性顯著增高(P＜0.05)，堿性磷酸酶染色的陽性細胞也顯著高于單純PLGA/CPC組織工程骨和空白對照組。③兔股骨髁骨缺損動物實驗顯示載阿侖膦酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨同樣有著良好的體內(nèi)生物相容性和成骨分化活性。植入后6周和12周，復合材料組的骨缺損修復均優(yōu)于對照組。假

13、手術組（單純股骨髁骨缺損組）股骨髁骨缺損未見明顯愈合;X線攝片示骨缺損處透光明顯;Micro-CT顯示骨覆蓋率(bonecoverage)在6周和12周分別為3.40±2.25％和6.10±4.48％，骨密度值(BMD)在6周和12周分別為31.04±5.8mg/cm3和50.80±8.8mg/cm3;HE染色顯示骨缺損處可見大量的纖維細胞，少見新骨形成。PLGA/CPC組織工程骨組股骨髁骨缺損見部分愈合;X線攝片示骨缺損處透光較弱;M

14、icro-CT顯示骨覆蓋率在6周和12周分別為12.89±5.74％和20.24±9.25％，骨密度值在6周和12周分別為57.08±8.4mg/cm3和81.80±10.8mg/cm3;HE染色示骨缺損處可見少量的纖維細胞，可見部分新骨形成，但新生骨小梁較為薄弱。阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨組股骨髁骨缺損見基本愈合;X線攝片示骨缺損處透光最弱;Micro-CT顯示骨覆蓋率在6周和12周分別為25.78±6.89％和45.

15、06±11.62％，骨密度值在6周和12周分別為88.92±9.9mg/cm3和115.98±12.2mg/cm3;HE染色示骨缺損處可見極少量的纖維細胞，可見大量的新骨形成，新生骨小梁粗大。
　　結論：⑴PLGA是良好的阿倫磷酸鈉的載體和緩釋體，載阿倫磷酸鈉的PLGA微球在降解后可使阿倫磷酸鈉緩慢釋放。⑵載阿倫磷酸鈉/PLGA/CPC復合組織工程骨具有良好的材料學性能，有合適的孔徑結構和力學性能。⑶體外實驗顯示載阿倫磷酸鈉/PL