人羊膜間充質干細胞與骨髓間充質干細胞生物學特性及免疫抑制作用比較.pdf

1、異基因造血干細胞移植(allogeneic hemotoic stem cell transplantation，allo-HSCT)是治療各種血液系統(tǒng)惡性腫瘤、重型再生障礙性貧血及重癥地中海貧血等的有效治療方法，但移植相關并發(fā)癥仍是威脅患者生命的重要因素，其中移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是移植后最嚴重最棘手的并發(fā)癥之一，急性移植物抗宿主病(aGVHD)是移植后患者非復發(fā)死亡的主要原因，

2、其發(fā)生必須具備三個前提:①移植物中含有足夠數(shù)量的識別和攻擊宿主異源性抗原的免疫活性細胞;②宿主應有與移植物不同的同種異體抗原;③宿主處于免疫無能狀態(tài)，對移植物不產生排斥。目前根據(jù)GVHD發(fā)病機制的不同，各種抗GVHD的化學藥物在臨床上廣泛應用，如人抗胸腺球蛋白(anti-humanthymocyte globulin，ATG)、抗TNF抗體英夫利昔、環(huán)孢素A(CsA)、他克莫司(FK506)等，但這些非特異性免疫抑制藥物本身具有毒副作用

3、且易導致病毒及真菌等感染，從而影響療效。如何降低allo-HSCT患者移植相關死亡率、提高患者生存率及生存質量，是目前臨床工作面臨的挑戰(zhàn)。
　　間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)作為中胚層來源的具有多向分化潛能的多能干細胞，MSC在體外可誘導分化為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經細胞等多種組織細胞，其經過多次傳代培養(yǎng)、凍存復蘇后仍具有多向分化潛能。且MSC具有造血支持、低免疫原性、免疫抑制及無致瘤

4、性等特點，近年來，隨著細胞替代治療與組織工程學的不斷發(fā)展，MSC已被應用于自身免疫性疾病、神經系統(tǒng)損傷、阿爾茲海默病、心血管疾病等多種疾病的治療研究，在血液學方面，已被應用于GVHD的預防和治療。目前骨髓仍是MSC的主要來源，在血液系統(tǒng)疾病方面，人骨髓間充質干細胞(human bone marrowmesenchymal stem cell，hBMSC)已被應用于臨床治療GVHD，但成人hBMSC細胞數(shù)量極少，并且增殖分化潛能隨年齡的增

5、大而下降，病毒感染率較高，供者hBMSC的采集須行有創(chuàng)性骨髓穿刺，亦使其來源受到限制。
　　引起aGVHD發(fā)生、發(fā)展的主要細胞為免疫活性細胞，即供者來源的成熟T淋巴細胞在患者體內的活化，可引起其一系列的反應，繼而激活并產生IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12及其受體等。其中IL-2和IFN-γ為Th1細胞因子，Th1細胞介導細胞免疫應答，在遲發(fā)型超敏反應、部分自身免疫性疾病、宿主體內抗胞內病原感染都起著重要作用，Th1細胞

6、與aGVHD的發(fā)生發(fā)展也有密切關系。而我們知道，hAMSC具有免疫抑制作用，而且其低表達HLA-ABC和HLA-G，不表達HLA-DR表面抗原，表現(xiàn)出低免疫源性和免疫抑制作用，且移植到動物體內無致瘤性，是較為理想的免疫赦免細胞，為各種疾病的細胞治療提供了新的選擇。在異基因造血干細胞移植中，如何平衡機體內Th1/Th2細胞及Ⅰ/Ⅱ型細胞因子，對于預防和治療GVHD具有重要意義。由此可見，人羊膜間充質干細胞可能為GVHD治療新的種子細胞，具

7、有潛在的臨床應用價值。
　　已有研究報道間充質干細胞幾乎存在于所有的組織器官中，且不同組織來源的間充質干細胞，其體外擴增的能力也不完全相同。已有研究報道了臍帶及胎肺來源的間充質干細胞與骨髓來源的間充質干細胞相比，前者的體外擴增能力明顯強于后者，前者可在傳代40多次后仍保持原有的生物學特性及增殖能力。因此，目前越來越多的研究組致力于尋找新的間充質干細胞，希望能夠替代骨髓間充質干細胞在臨床中的應用，以解決骨髓間充質干細胞來源不足的問題

8、。2004年研究者首次從人羊膜分離出間充質干細胞，經鑒定后發(fā)現(xiàn)其從羊膜中胚層分化而來，具有向三胚層分化的多潛能性，人羊膜間充質干細胞(humanamniotic mesenchymal stem cells，hAMSC)從健康產婦正常分娩后廢棄的胎盤組織中分離培養(yǎng)，羊膜組織來源充足，系產后廢棄物、不受倫理學限制，且羊膜不含有血管、神經、肌肉等組織，分離提純過程相對簡單、分離細胞純度較高。經免疫表型鑒定，hAMSC不僅表達間充質干細胞的表

9、面抗原，還表達干細胞相關表面抗原，如Oct-3、Oct-4、SSEA-3、SSEA-4等，這提示hAMSC可能還具有干細胞特性。近年來，人羊膜干細胞已經在角膜修復、燒傷性疾病、骨科疾病、脊髓損傷等相關疾病的臨床研究和治療取得療效。那么，hAMSC與hBMSC生物學特性相似，均具有間充質干細胞特性，且hAMSC可能還具有干細胞特性，細胞來源更豐富，是否可成為hBMSC的替代治療用于GVHD的預防和治療呢？
　　目的：
　　本實

10、驗通過對hAMSC和hBMSC生物學特性及對異體外周血淋巴細胞的免疫抑制功能的比較，希望為hAMSC治療GVHD、解決hBMSC來源不足的問題提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　通過酶消化法從健康剖宮產產婦志愿捐獻的新鮮胎盤羊膜中分離培養(yǎng)hAMSC，通過密度梯度離心法從健康供者志愿捐獻的骨髓中分離培養(yǎng)hBMSC。實驗分為兩部分:第一部分實驗為hAMSC與hBMSC生物學特性的比較，分別培養(yǎng)相同傳代代數(shù)的人羊膜來源與骨髓來源的MS

11、C，對二者進行細胞形態(tài)學觀察，通過CCK-8法檢測兩種細胞的增殖情況并生長曲線繪制，對兩種細胞進行細胞周期檢測，采用流式免疫分型技術分別對兩種細胞進行免疫表型鑒定，采用免疫熒光技術檢測兩種細胞的波形蛋白(vimentin);第二部分實驗為hAMSC和hBMSC對異體外周血淋巴細胞的免疫抑制功能的比較，經絲裂霉素處理后的hAMSC與hBMSC分別與植物血凝集素(phytohemagglutinin，PHA)刺激的異體人淋巴細胞共培養(yǎng)，分別

12、建立MSC與異體人外周血單個核細胞(PBMC)共培養(yǎng)體系，采用CCK-8法比較兩種不同共培養(yǎng)體系中淋巴細胞的增殖情況，采用ELISA法比較兩種不同共培養(yǎng)體系中細胞因子干擾素-γ(IFN-γ)的分泌水平。
　　結果：
　　(1)hAMSC與hBMSC細胞形態(tài)相似，hAMSC可傳至15代以上，hBMSC傳至第6-7代細胞后，開始老化、生長增殖能力明顯減弱;
　　(2)在細胞周期的比較中，hAMSC與hBMSC二者的G2/M

13、期細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);
　　(3)細胞免疫表型鑒定，hAMSC和hBMSC細胞表面均表達CD105、CD90、CD73，均不表達CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR，hAMSC表達Oct-3/4，而hBMSC不表達Oct-3/4;
　　(4)免疫熒光檢測結果顯示，hAMSC與hBMSC均表達vimentin;
　　(5)hAMSC和hBMSC均對PHA刺激的PBMC增殖具有抑制作

14、用，且隨著hAMSC和hBMSC細胞比例的增高，抑制能力增強，二者無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);
　　(6)ELISA結果提示，hAMSC+PBMC+PHA共培養(yǎng)組上清中IFN-γ水平較hBMSC+PHA+PBMC組低(P=0.056)，而hAMSC+PBMC+PHA共培養(yǎng)組及hBMSC+PHA+PBMC共培養(yǎng)組分別與PBMC+PHA組上清比較，IFN-γ水平明顯降低(P＜0.05)。
　　結論：
　　hAMSC比hB