重組葡激酶的表達(dá)純化及其纖溶活性的鑒定.pdf

1、目的：構(gòu)建葡激酶(staphy lokinase，SAK)基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)SAK蛋白，檢測其蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，純化該蛋白質(zhì)并初步鑒定其生物學(xué)活性，為臨床血栓性疾病的治療提供可能的溶栓新藥。
　　方法：基于生物信息學(xué)方法，分析優(yōu)化基因序列，使用基因合成技術(shù)合成葡激酶的基因序列，連接表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌克隆菌株DH-5α，運用PCR的方法篩選陽性克隆，提取雙酶切陽性的質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌B

2、L21菌株，使含有葡激酶目的基因的質(zhì)粒在BL21大量表達(dá)目的蛋白-葡激酶，利用離子交換柱(DEAE)，分子篩(superdex 75)等進(jìn)行分離純化，并用紫外核酸蛋白儀檢測目的蛋白的濃度，應(yīng)用纖維蛋白平板溶圈法測定并評價其溶栓生物活性。
　　結(jié)果：葡激酶在大腸桿菌中以可溶上清的方式高效表達(dá)，利用離子交換柱和分子篩等純化效果良好，純度達(dá)95％，以紫外核酸蛋白儀測蛋白濃度為2.05 mg/mL。體外實驗顯示其纖溶活性與尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)