激活型免疫受體復(fù)合物DAP12-NKG2C自組裝分子機制研究.pdf

1、自然殺傷細胞是淋巴細胞中的第三大組成部分，其功能涉及多種特定的抗感染以及抗腫瘤的自然免疫過程。自然殺傷細胞的激活狀態(tài)是通過自然殺傷細胞及其靶細胞之間的免疫突觸的激活信號以及抑制信號的不斷整合從而通過精確的調(diào)控達到平衡。激活型免疫受體復(fù)合物DAP12-NKG2C是自然殺傷細胞中一種進行激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的多亞基跨膜蛋白復(fù)合物。該復(fù)合物中的跨膜蛋白DAP12由一個較短的胞外區(qū)、一個單跨膜的跨膜區(qū)以及含有免疫酪氨酸激活基元(ITAM)的胞內(nèi)區(qū)這三部

2、分組成，DAP12能形成含二硫鍵的同源二聚體。該二聚體與受體NKG2C能夠通過跨膜區(qū)的極性殘基的相互作用從而發(fā)生聚集，并形成異源三聚體。研究者們最近已經(jīng)在膠束環(huán)境中取得了復(fù)合物DAP12-NKG2C跨膜區(qū)的晶體結(jié)構(gòu)，為我們提供了該復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)信息。然而，該晶體結(jié)構(gòu)表明跨膜蛋白復(fù)合物DAP12-NKG2C中關(guān)鍵的極性殘基接觸與其他實驗結(jié)果不能很好的吻合，令人疑惑的是該復(fù)合物中DAP12二聚體上的兩個天冬氨酸殘基只有一個與受體NKG2C

3、上的賴氨酸殘基有直接接觸。到目前為止，激活型免疫受體復(fù)合物DAP12-NKG2C的裝配原則仍然沒有得到完整的揭示，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制中的大量結(jié)構(gòu)信息細節(jié)也仍然處于缺失的狀態(tài)。
　　脂筏結(jié)構(gòu)位于細胞質(zhì)膜上，脂筏結(jié)構(gòu)內(nèi)富含飽和脂肪酸、膽固醇以及鞘磷脂等。在多種生理過程中，脂筏結(jié)構(gòu)通過募集數(shù)目眾多的跨膜蛋白來完成多種細胞膜內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與物質(zhì)運輸。此外，脂筏結(jié)構(gòu)也被認為是磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸(PIP2)與蛋白之間發(fā)生相互作用與信號調(diào)控的

4、平臺。近年來大量的實驗研究集中在脂筏結(jié)構(gòu)中的T細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及自組裝機制，然而得到的結(jié)果卻是矛盾的，而目前脂筏結(jié)構(gòu)在自然殺傷細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制中的作用尚不清楚，且尚無DAP12-NKG2C復(fù)合物自組裝與脂筏結(jié)構(gòu)關(guān)系的相關(guān)研究報道。
　　本論文中，我們采取生物化學(xué)、分子生物學(xué)等實驗方法與分子動力學(xué)模擬研究相結(jié)合的研究策略，對激活型免疫受體復(fù)合物DAP12-NKG2C的自組裝及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制進行研究，主要取得了以下研究進展:
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5、.我們采用TOXCAT系統(tǒng)作為主要的體內(nèi)實驗方法，結(jié)合其他體外實驗手段，確定了DAP12跨膜區(qū)的二聚自組裝及其二聚作用界面。CAT活性實驗結(jié)果表明，在DAP12跨膜區(qū)中的極性殘基天冬氨酸以及蘇氨酸能夠顯著影響其同源二聚信號，而其跨膜區(qū)序列中出現(xiàn)的常見二聚基元GXXXG則并不影響DAP12的二聚活性。由此我們確認極性殘基間的相互作用是DAP12跨膜區(qū)發(fā)生二聚自組裝的驅(qū)動力，D50XXXT54序列構(gòu)成其二聚界面。
　　2.根據(jù)TOXC

6、AT實驗結(jié)果，我們先后采用粗?；M方法以及全原子模擬方法對DAP12跨膜區(qū)的野生型及其突變體進行了二聚自組裝的分子動力學(xué)研究。通過對比野生型以及突變體的構(gòu)象變化，同樣發(fā)現(xiàn)了二聚界面上的重要極性殘基D50與T54。DAP12跨膜區(qū)同源二聚體主要采取左手裝配方式，二面交叉角約為20°。我們的實驗結(jié)果以及分子動力學(xué)模擬結(jié)果取得了非常好的一致性，并與膠束中得到的DAP12跨膜區(qū)二聚體NMR結(jié)構(gòu)非常相似。
　　3.隨后，我們同樣采用粗?；?/p>

7、模擬方法以及全原子模擬方法對激活型免疫受體復(fù)合物DAP12-NKG2C的跨膜區(qū)自組裝進行了分子動力學(xué)研究。通過計算機模擬結(jié)果及其他實驗結(jié)果，我們對該復(fù)合物跨膜區(qū)的NMR結(jié)構(gòu)進行了修正，提出了五個極性殘基構(gòu)成（包括DAP12二聚體中的一對天冬氨酸以及一對蘇氨酸，以及受體NKG2C中的一個賴氨酸）的相互作用界面。這個五極性殘基結(jié)構(gòu)在該異源三聚體的自組裝過程中形成了穩(wěn)定的靜電網(wǎng)絡(luò)，對維持其緊密裝配具有十分重要的作用。此外，我們進一步排除了DA

8、P12-NKG2C異源三聚體與另一條受體NKG2C鏈結(jié)合形成異源四聚體的可能性，并且提出了修正后的復(fù)合物DAP12-NKG2C跨膜區(qū)自組裝的裝配原則。
　　4.最后，我們采用粗?；M方法首次揭示了自然殺傷細胞中的免疫受體復(fù)合物DAP12-NKG2C以及脂分子PIP2在能夠形成脂筏結(jié)構(gòu)的混合膜中的定位情況。我們的分子動力學(xué)模擬結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)DAP12-NKG2C復(fù)合物的跨膜區(qū)位于非脂筏區(qū)，而其胞內(nèi)區(qū)則通過堿性殘基富集區(qū)以及ITAM區(qū)