真核生物非逆轉(zhuǎn)錄病毒內(nèi)生化與進(jìn)化基因組學(xué)研究.pdf

1、病毒是地球上目前所知的最古老、數(shù)量最多、適應(yīng)性最強(qiáng)的生物實(shí)體(biologicalentities),代表著巨大、多樣的新基因源,病毒進(jìn)化因而很可能也影響到宿主的進(jìn)化。研究病毒進(jìn)化不僅可以了解病毒的多樣性,預(yù)測(cè)和解釋新病毒病的出現(xiàn),而且可以深入認(rèn)識(shí)病毒-宿主間的互作關(guān)系,揭示病毒-宿主之間遺傳信息的交流。病毒基因組比較是研究病毒互作與進(jìn)化的重要方式,但是常常會(huì)受到數(shù)據(jù)的限制,比如可用的病毒基因組數(shù)據(jù)量偏少,或著樣本不具代表性。更重要的是

2、,病毒沒(méi)有化石,病毒進(jìn)化研究只能局限在現(xiàn)存病毒上。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)能夠發(fā)生基因組整合,在數(shù)百萬(wàn)年的進(jìn)化歷程中它們偶爾會(huì)內(nèi)生化(endogenization)到宿主基因組中形成內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒(endogenous retroviruscs)。這些內(nèi)源病毒序列實(shí)際上代表著古老病毒基因組的“分子化石”,保留了古代病毒與宿主互作的重要信息,因此對(duì)研究病毒-宿主長(zhǎng)期的互作與進(jìn)化歷史極為寶貴。此前一直認(rèn)為非逆轉(zhuǎn)錄病毒通常并

3、不能夠發(fā)生基因組整合,形成“病毒化石”的例子就更加罕見(jiàn)。
　　 本研究一方面立足于所在實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期研究的核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)——一種重要植物病原真菌,從中分子克隆和測(cè)序分析未知真菌病毒的全基因組序列；另一方面立足于不斷增長(zhǎng)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù),運(yùn)用生物信息學(xué)方法和技術(shù),從公共的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中電子克隆(cloning in silico)未知病毒的基因組序列,更重要的是,從真核生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖

4、掘(data mining)作為“病毒化石”的內(nèi)源非逆轉(zhuǎn)錄病毒序列。最后利用這些新得到的病毒基因組序列結(jié)合已有的相關(guān)病毒的數(shù)據(jù),在比較基因組學(xué)的框架內(nèi),以系統(tǒng)發(fā)育分析病毒基因和基因組序列為主要研究方式,全面了解病毒的多樣性、宿主范圍的廣泛性和非逆轉(zhuǎn)錄病毒內(nèi)生化現(xiàn)象,探討病毒內(nèi)生化機(jī)制、病毒起源進(jìn)化以及病毒-宿主在基因組水平上的互作關(guān)系,揭示病毒在真核生物進(jìn)化中的重要作用。本研究所取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.從核盤(pán)菌弱致病

5、力菌株gp-1PN中克隆到一種新RNA病毒,命名為核盤(pán)菌RNA病毒L(SsRV-L)。SsRV-L基因組全長(zhǎng)6043 bp(不包括3’-末端的polyA尾),僅具單個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼蛋白具有甲基轉(zhuǎn)移酶、RNA解旋酶和依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp)保守結(jié)構(gòu)域。序列比較表明該蛋白與隸屬ss(+)RNA病毒“類甲病毒”超組的人類戊型肝炎病毒(HEV)的復(fù)制酶具有顯著相似性,這是首次在真菌中報(bào)道與人類病毒具有顯著親緣關(guān)系的ss(

6、+)RNA病毒。系統(tǒng)發(fā)育分析表明SsRV-L可歸于“類甲病毒"超組內(nèi)的“類風(fēng)疹病毒”世系,與植物長(zhǎng)線形病毒(closteroviruses)、煙草花葉病毒(tobamoviruscs)、甜菜壞死黃脈病毒(bcnyviruscs)、昆蟲(chóng)四病毒(tetraviruscs),以及脊椎動(dòng)物戊型肝炎病毒(hepeviruses)和風(fēng)疹病毒(rubiviruses)都具有較近的親緣關(guān)系。并且這些病毒的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與宿主的分化相一致,表明其祖先可能起

7、源于宿主植物、真菌和動(dòng)物分化之前,隨后在長(zhǎng)期的進(jìn)化歷程中與宿主保持協(xié)同進(jìn)化,該發(fā)現(xiàn)對(duì)理解眾多的RNA病毒進(jìn)化世系的起源進(jìn)化以及新病毒的出現(xiàn)具有深遠(yuǎn)影響。另外,實(shí)驗(yàn)證明了SsRV-L能夠在宿主核盤(pán)菌細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制,對(duì)宿主生長(zhǎng)速度和致病力可造成輕微的影響,進(jìn)一步明確了引起Ep-1PN菌株弱致病力的因?yàn)?對(duì)研究病毒介導(dǎo)的植物病原真菌弱毒特性的分子機(jī)理具有重要意義。
　　 2從核盤(pán)菌強(qiáng)致病力菌株Sunf-M中克隆到一種新單分體(mono

8、partits)dsRNA病毒,命名為核盤(pán)菌dsRNA真菌病毒L(SsMV-L)。SsMV-L基因組全長(zhǎng)9124 bp,無(wú)polyA尾,具兩個(gè)長(zhǎng)ORF(ORFl和ORF2),5’-非翻譯區(qū)相對(duì)較長(zhǎng)(1088 bp)而3’-非翻譯區(qū)相對(duì)較短(54 bp)。ORF1推定編碼1304個(gè)氨基酸的蛋白,該蛋白具有磷酸庚糖異構(gòu)酶(Sugar ISomerase)保守結(jié)構(gòu)域的部分序列,但功能未知；ORF2推定編碼1337個(gè)氨基酸的蛋白,該蛋白具有RN

9、A病毒典型的RdRp保守結(jié)構(gòu)域,推測(cè)為病毒的復(fù)制酶。對(duì)SsMV-L及其相關(guān)的dsRNA病毒類群進(jìn)行了全面的系統(tǒng)發(fā)育分析和基因組結(jié)構(gòu)比較,研究結(jié)果表明SsMV-L代表一類新單分體dsRNA病毒世系,而單分體dsRNA病毒實(shí)際上具有多樣化的病毒世系,當(dāng)前的病毒分類系統(tǒng)已不能滿足需要,可考慮成立新的病毒科或在已有單分病毒科(Totiviridae)內(nèi)增加新屬以容納這些不同的病毒進(jìn)化世系。系統(tǒng)發(fā)育分析還表明基因組為4節(jié)段的產(chǎn)黃青霉病毒(chry

10、soviruscs)可能由單分體dsRNA病毒進(jìn)化而來(lái)。令人驚奇的是,SsRV-L復(fù)制酶RdRp結(jié)構(gòu)域的下游還具有植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)成員所特有的S7核心蛋白結(jié)構(gòu)域的同源序列,通過(guò)PSI-BLAST分析,發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域廣泛存在于多種RNA病毒類群中,包括產(chǎn)黃青霉病毒、內(nèi)源RNA病毒(endornaviruses)以及一些未歸類的單分體dsRNA病毒。結(jié)構(gòu)域排列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析表明S7結(jié)構(gòu)域序列可能起源于植物呼腸

11、孤病毒屬病毒,并且在不同種類的dsRNA病毒間發(fā)生過(guò)多次水平基因轉(zhuǎn)移事件。該發(fā)現(xiàn)首次證明遺傳關(guān)系非常疏遠(yuǎn)的dsRNA病毒類群間也能夠發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移事件,揭示了dsRNA病毒宏觀進(jìn)化(macroevolution)的分子機(jī)制。
　　 3.從核盤(pán)菌Sunf-M菌株中克隆到一種新雙分體(bipartite)dsRNA病毒,命名為核盤(pán)菌雙分病毒S(SsPV-S)。SsPV-S基因組包含大小相似的兩個(gè)片段:S-1和S-2,長(zhǎng)度分別為18

12、56和1783 bp(不包括正鏈3’-末端的polyA尾),各含一個(gè)ORF,分別編碼病毒的RdRp和衣殼蛋白(CP)。對(duì)SsPV-S及目前已報(bào)道的雙分病毒(partitiviruses)進(jìn)行全面的系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果表明這些病毒主要形成4個(gè)單系類群。同一單系類群中可包括侵染真菌的雙分病毒(Partitivirus)和侵染植物的雙分病毒(Alphacryptovirus),表明雙分病毒可能在植物和真菌間發(fā)生過(guò)水平轉(zhuǎn)移,同時(shí)也說(shuō)明當(dāng)前雙分病毒

13、科(Partitiviridae)的分類并不能反映病毒真實(shí)的進(jìn)化關(guān)系。值得說(shuō)明的是,SsPV-S的CP蛋白與擬南芥生長(zhǎng)素一亮氨酸抗性蛋白2(ILR2)具有最高的氨基酸相似性,而與其它雙分病毒的CP蛋白相似性都較低,表明病毒與擬南芥基因組之間可能發(fā)生過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移事件。
　　 4.通過(guò)電子克隆技術(shù)從NCBI EST數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆到120多條類似單分病毒、雙分病毒、產(chǎn)黃青霉病毒和內(nèi)源RNA病毒的新RNA病毒基因組序列,其中類似雙分病毒

14、的新病毒序列達(dá)到106條,幾乎使已知雙分病毒的種類翻了一倍。這些序列不僅代表先前未報(bào)道的病毒,而且很多來(lái)自新的宿主甚至新的宿主類群。例如許多類似單分病毒和內(nèi)源RNA病毒的序列來(lái)自動(dòng)物,而目前這類病毒并未發(fā)現(xiàn)侵染動(dòng)物。更重要的是,通過(guò)對(duì)這些新得到的病毒序列以及已報(bào)道的相關(guān)病毒序列進(jìn)行全面的系統(tǒng)發(fā)育分析,揭示了這些病毒與宿主的互作與進(jìn)化關(guān)系,即這些病毒的祖先可能起源于真核宿主超群(supergroup)分化之前,在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷史中與宿主協(xié)同

15、進(jìn)化并伴隨頻率的宿主轉(zhuǎn)移事件。該研究證明電子克隆方法具有發(fā)現(xiàn)新病毒的巨大潛力,通過(guò)該方法的運(yùn)用極大地增強(qiáng)了我們對(duì)dsRNA病毒多樣性、宿主范圍廣泛性以及病毒一宿主互作與進(jìn)化的認(rèn)識(shí)。
　　 5.通過(guò)對(duì)dsRNA病毒和真核生物基因組進(jìn)行系統(tǒng)地?cái)?shù)據(jù)比較,鑒定真核基因組中內(nèi)源dsRNA病毒序列,研究結(jié)果表明單分病毒和雙分病毒都存在廣泛的內(nèi)生化現(xiàn)象?？偣矎膩?lái)自植物、節(jié)肢動(dòng)物、真菌、線蟲(chóng)、腹足動(dòng)物和原生動(dòng)物等類群的20多種真核生物的核基因組

16、中鑒定出22個(gè)類似雙分病毒和34個(gè)類似單分病毒RdRp或CP基因的序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序以及計(jì)算分析證明這些序列是真正存在于真核生物基因組中的內(nèi)源病毒序列。序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析進(jìn)一步證明這些序列來(lái)自單分病毒和雙分病毒的內(nèi)生化。鑒于許多內(nèi)源病毒序列來(lái)自目前還未報(bào)道被單分病毒和雙分病毒侵染的真核類群,本研究延伸了這些病毒的宿主范圍。另外,通過(guò)分析內(nèi)源病毒基因的保守性和表達(dá)情況,證明一些內(nèi)源病毒基因,例如擬南芥和白菜(Brassica

17、rapa)基因組中的雙分病毒CP類似基因和果蠅(Drosophila grimshawi)基因組中的雙分病毒RdRp類似基因不僅存在序列保守性而且能夠表達(dá),尤其是擬南芥中的CP類似基因(ILR2)已被證明具有調(diào)節(jié)植物激素吲哚乙酸生物合成的功能。本研究提供翔實(shí)的證據(jù)證明dsRNA病毒的遺傳材料可以水平轉(zhuǎn)移到多樣的真核生物基因組中,并可能產(chǎn)生有重要功能的新基因,表明RNA病毒在真核生物進(jìn)化中扮演了重要角色。
　　 6.通過(guò)對(duì)線性ss

18、DNA病毒和真核生物基因組進(jìn)行系統(tǒng)地?cái)?shù)據(jù)比較,鑒定真核基因組中內(nèi)源線性ssDNA病毒的序列,研究結(jié)果表明細(xì)小病毒(parvoviruses)和濃核病毒(densoviruses)都存在廣泛的內(nèi)生化現(xiàn)象?？偣矎膩?lái)自哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、魚(yú)類和背囊動(dòng)物等類群的37種真核生物核基因組中鑒定出62個(gè)細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)類似序列和77個(gè)CP類似序列；從來(lái)自甲殼綱、蛛形綱和昆蟲(chóng)綱動(dòng)物以及扁形蟲(chóng)等類群的9種真核生物核基因組中鑒定出92個(gè)濃核病毒NS類

19、似序列和44個(gè)CP類似序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序以及計(jì)算分析證明這些序列是真正存在于真核生物基因組中的內(nèi)源病毒序列。值得說(shuō)明的是魚(yú)類、背囊動(dòng)物和扁形蟲(chóng)當(dāng)前并未發(fā)現(xiàn)被細(xì)小病毒侵染,但其基因組中存在內(nèi)源病毒序列清楚的表明它們被或曾經(jīng)被相關(guān)病毒侵染。序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析證明許多內(nèi)源病毒序列非常古老,至少在動(dòng)物基因組中存在了數(shù)百萬(wàn)年。特別是在人類和其它哺乳動(dòng)物的基因組中鑒定出一個(gè)類似細(xì)小病毒CP基因的直系同源(orthologous)序列,表

20、明細(xì)小病毒與哺乳動(dòng)物宿主共存至少有9,800萬(wàn)年的歷史,此類病毒的進(jìn)化時(shí)間超出前人想象,同時(shí),這也是迄今發(fā)現(xiàn)的最古老的“病毒化石”。另外,通過(guò)表達(dá)分析證明部分內(nèi)源細(xì)小病毒基因在真核生物基因組中可以表達(dá),表明細(xì)小病毒可能作為宿主未曾預(yù)料的遺傳革新源(source of genetic innovation)?？傊?內(nèi)源細(xì)小病毒和濃核病毒的發(fā)現(xiàn)提供了表征病毒入侵的“化石記錄”,從而有助于揭示其與宿主的進(jìn)化歷史,增強(qiáng)了我們對(duì)病毒一宿主互作的認(rèn)

21、識(shí)。
　　 7.通過(guò)對(duì)環(huán)形ssDNA病毒和真核生物基因組進(jìn)行系統(tǒng)地?cái)?shù)據(jù)比較,鑒定真核基因組中類似環(huán)形ssDNA病毒的序列,研究結(jié)果表明類似雙生病毒(geminiviruses)、矮縮病毒(nanoviruses)和圓環(huán)病毒(circoviruses)的內(nèi)源序列廣泛存在于真核生物核基因組中?？偣矎膩?lái)自真菌、植物和原生動(dòng)物等類群的12種真核生物核基因組中鑒定出31個(gè)雙生病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep)類似序列和1個(gè)CP類似序列；從來(lái)自綠藻

22、類、硅藻類、脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物等類群的23種真核生物核基因組中鑒定出271個(gè)圓環(huán)病毒和矮縮病毒Rcp類似序列和2個(gè)CP類似序列。通過(guò)PCR擴(kuò)增、測(cè)序以及計(jì)算分析證明這些序列是真正存在于真核生物基因組中的內(nèi)源病毒序列。通過(guò)將這些內(nèi)源病毒序列與已知的環(huán)狀ssDNA病毒以及真核或原核滾環(huán)復(fù)制質(zhì)粒進(jìn)行序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析,不僅揭示了環(huán)狀ssDNA病毒的多樣性和宿主范圍的廣泛性,而且重構(gòu)了這些病毒與宿主長(zhǎng)期的進(jìn)化歷史,并對(duì)雙生病毒、矮縮病毒和