釀酒酵母乙醇脫氫酶2和乙醛脫氫酶以及兩種水生動物抗菌肽的表達和酶活分析.pdf

1、1乙醇脫氫酶2和乙醛脫氫酶的表達及酶學性質(zhì)分析
　　 釀酒酵母中的乙醇脫氫酶2催化乙醇氧化生成乙醛,乙醛脫氫酶催化乙醛氧化生成乙酸。本研究從釀酒酵母基因組中分別克隆、表達乙醇脫氫酶2和乙醛脫氫酶,對其進行了純化,然后體外測定酶活及酶動力學分析。為研發(fā)新型解酒食品提供理論基礎。主要內(nèi)容如下:
　　 1.1從釀酒酵母基因組DNA擴增獲得6種酶的基因并構(gòu)建了6個表達載體,pRX2-ADH2、pRX2-ALDH6、pRX2-AL

2、DH2、pRX2-ALDH3、pRX2-ALDH4和pRX2-ALDH5,分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21,通過乳糖自誘導表達目的蛋白,6種酶得到成功表達,但ADH2和ALDH4主要以包涵體形式表達；
　　 1.2重新構(gòu)建3個表達載體,pGEX-ADH2,pBAD-ADH2和pBAD-ALDH4,優(yōu)化表達條件,初步判斷ALDH4以可溶性形式表達,ADH2仍然以包涵體形式表達；
　　 1.3采用Ni-NTA His.Bind

3、 Resin親和層析柱純化帶有6His·Tag的重組蛋白,純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測目的蛋白的純度約為90％；采用Bradford蛋白測定法測得ADH2、ALDH6、ALDH2、ALDH3和ALDH5濃度分別為2.07mg／mL,1.624mg／mL,0.6635 mg／mL,0.7596 mg／mL和0.9615 mg／mL；
　　 1.4體外測定復性后的ADH2和純化得到的乙醛脫氫酶活性,通過紫外可見分光光度計測定產(chǎn)物β-

4、NADH和β-NADPH的生成量,結(jié)果顯示ADH2、ALDH6、ALDH2、ALDH3和ALDH5的比活力分別約為2.107U／mg,16.86U／mg,1.416U／mg,1.566U／mg和2.742U／mg;
　　 1.5研究溫度、pH值和金屬離子對ADH2和乙醛脫氫酶活力的影響。得出ADH2、ALDH6、ALDH5、ALDH2和ALDH3最適溫度分別為45℃,30℃,37℃,37℃和50℃,最適pH值分別為7.4,7.4

5、,8.0,7.4和8.5。
　　 1.6研究ADH2和乙醛脫氫酶酶動力學性質(zhì)。ADH2對NAD+和乙醇的Km分別為1.1mM和120μM,ALDH6和ALDH5對NADP+和乙醛的Km分別為(101μM,42μM)和(664μM,129μM),ALDH2和ALDH3對NAD+和氨基丙醛的Km分別為(471μM,17.5μM)和(410μM,8.6μM)。
　　 2兩種抗菌肽的克隆、表達及活性分析
　　 將兩種水生

6、動物分泌的抗菌肽基因克隆到原核表達載體pGEX-4T-1上,構(gòu)建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1兩個融合蛋白表達載體,轉(zhuǎn)化至表達宿主菌Escherichia coli Rosetta中進行表達,表達的融合蛋白主要以包涵體形式存在。融合蛋白經(jīng)復性、酶切處理獲得抗菌Y18和CEC1。抑菌實驗結(jié)果表明,融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CEC1都能有效地抑制E.coli DH5α、Bacillus subtilis