胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1相關(guān)研究.pdf

1、胰島素樣生長因子-1、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1相關(guān)研究胰島素樣生長因子-1(Insulin-likegrowthfactor-1IGF-1)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1(Insulin-likegrowthfactorbindingprotein-1IGFBP-1)是有重要功能的蛋白質(zhì)因子。它們具有相互作用，目前已知這種相互作用可以調(diào)節(jié)游離IGF-1含量、改變其分布，進而對生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展、糖代謝等產(chǎn)生影響，但這些作用機制尚

2、不十分清楚。此外，IGF-1具有胰島素樣作用，但因種種原因阻礙其在糖尿病治療中的應(yīng)用。我們根據(jù)分子生物學(xué)、生物信息學(xué)理論，采用基因重組表達、酵母三雜交等技術(shù)對影響IGF-1、IGFBP-1作用過程中的蛋白質(zhì)因子進行篩選，構(gòu)建IGF-1突變體并對其進行了系列研究。全文共分兩個部分： 一、IGF-1基因克隆和突變體構(gòu)建、表達及功能研究采用PCR方法，從人胎肝cDNA文庫中成功釣取了IGF-1基因，并根據(jù)生物信息學(xué)理論結(jié)合文獻報道構(gòu)建

3、了兩個IGF-1突變體——IGF97、IGF191。利用pGEX-4T-1構(gòu)建了IGF-1、IGF97、IGF191原核表達載體，在大腸桿菌中實現(xiàn)了突變體融合表達，采用親和層析法和凝血酶切割分離獲得重組IGF97、IGF191蛋白。采用pcDNA3.1構(gòu)建了真核表達載體，實現(xiàn)了IGF-1、IGF97、IGF191在COS-7細胞實現(xiàn)表達；觀察了純化的突變體IGF97、IGF191和純品IGF-1對內(nèi)皮細胞ECV304增殖的影響，并將構(gòu)建

4、的真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞ECV304后觀察細胞增殖情況，結(jié)果顯示IGF-1、IGF97對細胞具有同樣的促增殖作用，而IGF191促增殖作用明顯低于IGF-1。還采用雞胚尿囊膜血管觀察技術(shù)在體觀察了IGF-1、IGF97、IGF191對新生血管形成的影響，結(jié)果顯示：IGF-1、IGF97具有促血管新生作用，而IGF191明顯弱于IGF-1，綜上結(jié)果提示突變體IGF191促組織細胞生長作用明顯減弱。 二、影響IGF-1、IGFBP

5、-1相互作用蛋白的研究酵母三雜交是近年發(fā)展出來的研究三個蛋白質(zhì)間相互作用的新技術(shù)。采用CLONTECH公司酵母三雜交技術(shù)對IGF-1、IGFBP-1進行了研究。首先對酵母三雜交系統(tǒng)進行了檢驗，構(gòu)建含IGF-1、IGFBP-1的橋蛋白質(zhì)粒，在對橋質(zhì)粒分析過程中發(fā)現(xiàn)野生型IGFBP-1具有轉(zhuǎn)錄激活活性。根據(jù)生物信息學(xué)的理論和技術(shù)，分析了IGFBP-1結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，構(gòu)建了兩個IGFBP-1突變體M1、M2，結(jié)果突變體M2成功地將IGFBP-

6、1轉(zhuǎn)錄激活活性缺失。最后，利用酵母三雜交技術(shù)從人胎肝cDNA文庫中篩選出3個與IGF-1、IGFBP-M2具有相互作用的蛋白：鐵蛋白、血紅蛋白(Hb)、低分子量泛醌結(jié)合蛋白，它們都與能量代謝、組織細胞生長有關(guān)，這些功能都與IGF-1、IGFBP-1所介導(dǎo)的生物學(xué)作用相關(guān)聯(lián)，所以這些蛋白與IGF-1、IGFBP-1同時作用具有的生物學(xué)意義值得進一步探討。 總之，通過構(gòu)建IGF-1突變體并在原核、真核細胞中實現(xiàn)IGF-1及其突變體I