假單胞菌株M18中rhl菌群傳感系統(tǒng)和調(diào)控基因pltR的鑒定及功能研究.pdf

1、熒光假單胞菌(Pseudomonas sp.M18)是從上海郊區(qū)甜瓜根際分離篩選到的一株具有生物防治功能的假單胞菌新種。M18生防作用主要歸功于其可分泌多個抗生物質(zhì),包括藤黃綠菌素(pyoluteorin,Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)等。本研究試圖在分子水平上鑒定藤黃綠菌素合成相關(guān)的生物調(diào)控因子,揭示和闡明這些調(diào)控因子和藤黃綠菌素生物合成之間的關(guān)系。并以這些調(diào)控因子為靶向,構(gòu)

2、建Plt高產(chǎn)工程菌株,提高M18的Plt產(chǎn)量,增強其生物防治能力。本研究主要包括四個方面內(nèi)容:
　　 第一方面,本課題組利用雙元報告轉(zhuǎn)座子mini-Tn5 lacZ-ter/1,篩選了若干后期菌群傳感應答基因突變株。與野生型菌株相比,M46-11、M49-2和M58-17的表型具有顯著變化,它們分別具有Plt不產(chǎn)、涌動能力降低和紅色素合成能力缺失的特征。利用分子生物學的方法,鑒定和分析了相應的突變基因,證實M58-17為潛在的菌

3、群傳感突變株。研究過程中還發(fā)現(xiàn),M18菌株能夠分泌高絲氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserine lactones,AHLs),其降解(M18/pME6863)或缺失(M58-17)均可以影響抗生素的產(chǎn)量,從而推測AHL類型菌群傳感系統(tǒng)存在于該菌株中,并且可能介入了抗生素生物合成的調(diào)控體系。
　　 第二方面,生物信息學分析顯示,藤黃綠菌素生物合成基因簇啟動子區(qū)域存在一個潛在的LuxR家族蛋白作用位點(lux box),表明M18

4、菌株中潛在的菌群傳感(quorum sensing QS)系統(tǒng)可能直接參與了Plt生物合成的調(diào)控?；谝酝z傳學分析和突變株58-17突變基因序列分析表明,假單胞菌株M18兼有熒光假單胞和銅綠假單胞菌的遺傳學背景,并且部分的rhl1/基因序列十分相似(相似度99％)。據(jù)此設計保守引物,擴增得到M18菌株中的rhlR和rhl1基因。序列分析結(jié)果顯示,rhlR和rhl1基因及表達蛋白質(zhì)序列與銅綠假單胞PAO1(Pseudomonas aer

5、uginosaPAO1)高度相似。因此,M18菌株中的這個菌群傳感系統(tǒng)也命名為rhl菌群傳感系統(tǒng)(RhlR and RhlI)。
　　 慶大霉素抗性基因(Gm)插入突變株M18IG(rhlI：Gm)喪失了合成N-butyryl-homoserine lactone(BHL)和N-hexanoyl-homoserine lactone(HHL)這兩種AHL信號分子的能力,但其Plt產(chǎn)量比野生型提高了5倍,同時抑制另一個抗生物質(zhì)PC

6、A的生物合成?？强剐曰?Km)插入失活rhlR基因后得到突變株M18RK(rhlR：Km),其Plt和PCA合成變化趨勢與突變株M18IG相似。藤黃綠菌素pltLA’-‘lacZ翻譯融合和吩嗪-1-羧酸phzA’-‘lacZ翻譯融合在突變株中的表達情況表明,rhlI和rhlR在基因表達水平上調(diào)控這兩種抗生素的生物合成。RhlR和RhlI組成一個有機統(tǒng)一的rhl菌群傳感系統(tǒng),參與調(diào)控Plt和PCA生物合成。隨后的信號分子添加實驗又證明

7、,BHL信號分子而非HHL在該調(diào)控中發(fā)揮了主導作用。
　　 野生型菌株M18,突變株M18IG和M18RK中pltA基因的mRNA熒光定量PCR分析結(jié)果顯示,突變菌株中pltA基因的mRNA水平是野生型的4至5倍。這表明rhl菌群傳感系統(tǒng)負調(diào)控Plt生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄。rhl菌群傳感系統(tǒng)突變菌株中,plt轉(zhuǎn)錄融合表達質(zhì)粒pMEAZ-12的表達水平也提高了將近5倍。與此形成鮮明對比的是,另一plt轉(zhuǎn)錄融合表達質(zhì)粒pMEAZ-13

8、在rhl菌群傳感系統(tǒng)突變菌株中的表達水平卻和野生型菌株一致。這兩個轉(zhuǎn)錄融合表達質(zhì)粒的區(qū)別在于pMEAZ-13比pMEAZ-12少了啟動子和基因編碼區(qū)之間的176 bp間隔序列。這些結(jié)果進一步證明了rhl菌群傳感系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平上負調(diào)控Plt的生物合成；另一方面也表明,176 bp的間隔序列是調(diào)控相關(guān)的重要位點。同時也揭示潛在的lux box在此調(diào)控過程中并不發(fā)揮所預測的生物學功能。
　　 同時,rhl菌群傳感系統(tǒng)的突變(M18IG

9、和M18RK)促進了ABC(ATP-bindingcassette)轉(zhuǎn)運基因簇pltHIJKNO的表達,而后者負責轉(zhuǎn)運分泌Plt而促進Plt的產(chǎn)生。rhlI pltB雙突變菌株M18TI和rhlR pltB雙突變菌株M18TR不再合成Plt,轉(zhuǎn)運基因簇pltHIJKNO在這兩雙突變菌株中的表達又顯著降低,只有野生型水平的一半。這些結(jié)果表明rhl菌群傳感系統(tǒng)必須以Plt為媒介,從而負調(diào)控轉(zhuǎn)運基因簇pltHIJKNO的表達。
　　

10、第三方面,在Plt生物合成基因簇上游鑒定了一個Plt生物合成正調(diào)控因子編碼基因pltR。pltR突變株M18TRG和pltR過表達菌株M18(pME6032PLTR)中Plt、PCA的產(chǎn)量以及Plt生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄結(jié)果表明,pltR在轉(zhuǎn)錄水平上對Plt的生物合成進行路徑特異性的正調(diào)控。在rhl菌群傳感系統(tǒng)突變株M18IG和M18RK中,pltR’-‘lacZ翻譯融合表達增加,表明PltR表達受rhl菌群傳感系統(tǒng)負調(diào)控,從而后者對藤黃

11、綠菌素生物合成進行負調(diào)控。
　　 此外,pltR’-‘lacZ翻譯融合在不同突變株中的差異性表達表明PltR處于Plt生物合成調(diào)控體系下游,其介導了GacA/GacS對Plt生物合成的正調(diào)控作用,但不介入RsmA對Plt生物合成的負調(diào)控作用。Plt本身也不影響pltR基因的表達。
　　 第四方面,在研究藤黃綠菌素和吩嗪-1-羧酸二者生物合成的相互關(guān)系時發(fā)現(xiàn),吩嗪-1-羧酸的生物合成在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制了藤黃綠菌素的產(chǎn)生；而