五味子木脂素的止咳作用及抗氧化機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　慢性咳嗽是咳嗽癥狀持續(xù)時間大于8周的一種臨床主訴，在所有慢性咳嗽的疾患中，有高達(dá)12-46％的患者卻一直不能明確病因。目前其僅有的病理生理特征為氣道的非特異性炎癥伴隨氣道咳嗽受體：瞬時受體電位香草酸亞型1（Transientreceptorpotentialvanilloid1,TRPV1）、瞬時受體電位錨蛋白1（Transientreceptorpotentialankyrin1,TRPA1）的增加。難治性咳嗽、特發(fā)

2、性咳嗽、咳嗽高敏綜合征（CoughHypersensitiveSyndrome，CHS），都是國際上對于此類慢性咳嗽的命名。
　　研究表明長期吸入香煙煙霧或環(huán)境污染物可以引起氣道TRP受體的增加。兩者在燃燒過程中可以產(chǎn)生大量的活性氧，主要包括·OH以及H2O2等?；钚匝蹩梢灾苯优c咳嗽受體（TRPV1、TRPA1等）結(jié)合，從而激動咳嗽反射。但引起咳嗽與導(dǎo)致咳嗽敏感性增加二者是有本質(zhì)區(qū)別的，長期吸入會最終演變成CHS嗎？若長期吸入活性

3、氧可以最終導(dǎo)致慢性咳嗽或者形成CHS這個假設(shè)成立，那長期對抗氣道氧化應(yīng)激或許可以成為治療難治性慢性咳嗽或者CHS的一種手段。
　　國內(nèi)外研究提示五味子的提取物，尤其是木脂素具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可以用于治療各種氧化應(yīng)激損傷。我們課題組前期研究也表明五味子的醇提物可以有效抑制香煙煙霧導(dǎo)致的豚鼠慢性咳嗽以及氣道TRPV1、TRPA1的表達(dá)。但其降低咳嗽敏感性的機(jī)制尚未明確。鑒于五味子提取物具有較強(qiáng)的抗氧化作用，推測醇提物中含量最大的4

4、種木脂素降低咳嗽敏感性與抗氧化機(jī)制有一定關(guān)系。
　　第一部分、H2O2氧化應(yīng)激的小鼠咳嗽模型建立
　　研究目的：
　　觀察單純氣道H2O2氧化應(yīng)激損傷與小鼠咳嗽敏感性的關(guān)系，確立氧化應(yīng)激的小鼠咳嗽模型最佳的暴露時間以及H2O2損傷濃度。
　　研究方法：
　　按照霧化天數(shù)（3天，7天，10天，14天）、霧化濃度（0.2%，1%，5%），將小鼠進(jìn)行霧化，每天霧化兩次。并在3個濃度梯度中選擇咳嗽次數(shù)最多的天數(shù)組設(shè)

5、立乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)干預(yù)組。乙酰半胱氨酸灌胃操作在兩次霧化之間進(jìn)行。霧化結(jié)束后，隔一天進(jìn)行辣椒素咳嗽敏感性測試。然后處死小鼠，收集小鼠肺泡灌洗液進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞分類處理；收集肺葉進(jìn)行瞬時受體電位香草酸亞型1（Transientreceptorpotentialvanilloid1,TRPV1）、瞬時受體電位錨蛋白1（Transientreceptorpotentialankyrin1,TRP

6、A1）的mRNA表達(dá)測定、超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathioneperoxidase,GSH-px）的檢測；留取一部分小鼠的肺組織進(jìn)行HE染色病理切片檢測。
　　研究結(jié)果：
　?、俑邼舛冉M霧化3天后，低濃度組、中濃度組分別在霧化7天后，三組小鼠的咳嗽敏感性達(dá)到最高值，與正常組相比，有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。達(dá)到最高值后咳嗽敏感性逐漸下降。對高濃度霧化3

7、天組、低濃度霧化7天組、中濃度霧化7天組分別設(shè)立NAC灌胃干預(yù)組，咳嗽敏感性均有明顯下降，與對應(yīng)模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。
　?、诟邼舛冉M霧化3天后，低濃度組、中濃度組分別在霧化7天后，三組小鼠的肺泡灌洗液（BronchoalveolarLavageFluid,BALF）中的細(xì)胞總數(shù)達(dá)到最高值，與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。達(dá)到最高值后細(xì)胞總數(shù)逐漸下降。3個NAC灌胃干預(yù)組，細(xì)胞總數(shù)均有明顯下降，與對應(yīng)的

8、模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。
　?、鄹邼舛冉M霧化3天后，低濃度組、中濃度組分別在霧化7天后，三組小鼠的肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞比例達(dá)到最高值，與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。達(dá)到最高值后中性粒細(xì)胞比例逐漸下降。3個NAC灌胃干預(yù)組，中性粒細(xì)胞比例均有明顯下降，除高濃度組外，低、中濃度組與對應(yīng)模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。
　?、芨邼舛冉M霧化3天后，低濃度組、中濃度組分別在霧化7天后，三組小鼠的

9、肺組織的超氧化物歧化酶（SOD）活力達(dá)到最低值，與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。達(dá)到最低值后SOD活力逐漸上升。3個NAC灌胃干預(yù)組，SOD活力均有明顯上升，除中濃度組外，低、高濃度組與對應(yīng)模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。
　?、莞邼舛冉M霧化3天后，低濃度組、中濃度組分別在霧化7天后，三組小鼠的肺組織中的TRPV1、TRPA1mRNA表達(dá)水平達(dá)到最高值，與對照組小鼠肺組織的TRPV1、TRPA1mRNA表達(dá)相比較

10、均有顯著上升（p<0.05）。3個小組達(dá)到最高值后逐漸下降。3個NAC干預(yù)組小鼠肺組織中TRPV1、TRPA1的mRNA表達(dá)mRNA表達(dá)水平均有明顯下降，與相應(yīng)的模型組相比較均有顯著下降（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　H2O2高濃度霧化3天、低濃度霧化7天、中濃度霧化7天均可以使小鼠咳嗽敏感性升高且伴有氣道炎癥，TRPV1、TRPA1表達(dá)的增高，低濃度組霧化7天各指標(biāo)與正常組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異，選擇0.2%H2O2霧化7

11、天作為造模標(biāo)準(zhǔn)。
　　第二部分、五味子木脂素對H2O2氧化應(yīng)激小鼠咳嗽模型的藥理作用
　　研究目的：
　　探討4種五味子木脂素單體對H2O2氧化應(yīng)激咳嗽模型的藥理作用
　　研究方法：
　　SPF級別雄性Balb/c小鼠隨機(jī)分為五味子醇甲組、五味子甲素組、五味子醇乙組、五味子乙素組、五味子醇提物組、NAC組，并設(shè)立正常對照組、模型對照組。所有藥物干預(yù)組均予0.2%H2O2霧化7天造模，每天兩次，兩次之間相隔大

12、于5h。兩次霧化之間予藥物干預(yù)灌胃，4種五味子木脂素單體灌胃濃度均為1.6mg/kg，五味子醇提物灌胃濃度為80mg/kg，NAC灌胃濃度為100mg/kg。第8天時停止灌胃與霧化，進(jìn)行辣椒素咳嗽敏感性測試，并在測試完后眼球取血處死小鼠，收集小鼠肺泡灌洗液進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞分類處理；收集肺葉進(jìn)行TRPV1、TRPA1的mRNA表達(dá)測定、SOD、GSH-px的檢測；留取一部分小鼠的肺組織進(jìn)行HE染色病理切片檢測。
　　研究結(jié)果：

13、r>　?、倥c正常組相比，模型組咳嗽次數(shù)顯著上升（p<0.05）；五味子醇甲組、五味子甲素組、五味子醇乙組、五味子乙素組、五味子醇提物組、NAC組咳嗽次數(shù)與模型組相比較均有顯著下降（p<0.05）。
　?、谂c正常組相比較，模型組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)顯著上升（p<0.05）；五味子醇甲組、五味子甲素組、五味子醇乙組、五味子乙素組、五味子醇提物組、NAC組BALF中細(xì)胞總數(shù)均有顯著下降，與模型組相比較，除五味子醇甲組外均有統(tǒng)計學(xué)差異（

14、p<0.05）。
　?、叟c正常組相比，模型組BALF的中性粒細(xì)胞比例顯著上升（p<0.05）；五味子醇甲組、五味子甲素組、五味子醇乙組、五味子乙素組、五味子醇提物組、NAC組小鼠BALF中的中性粒細(xì)胞比例均有顯著下降，與模型組相比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。
　　④與正常組相比，模型組小鼠肺組織中GSH-px、SOD活力均有顯著地下降（p<0.05）；五味子醇甲組、五味子甲素組、五味子醇乙組、五味子乙素組、五味子醇提物

15、組、NAC組肺組織中GSH-px、SOD活力均有明顯升高，與模型組相比，除五味子甲素組外，均有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。
　?、菖c正常組比較，模型組小鼠肺組織中TRPV1的mRNA表達(dá)均顯著升高（p<0.05）；五味子醇甲組、五味子甲素組、五味子醇乙組、五味子乙素組、五味子醇提物組、NAC組小鼠肺組織中TRPV1、TRPA1的mRNA表達(dá)均有明顯下降，與模型組相比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　4

16、種五味子單體均可以明顯抑制氣道氧化應(yīng)激造成的咳嗽，其鎮(zhèn)咳機(jī)制可能與抑制氧化損傷、減緩氣道炎癥，從而減少氣道TRPV1、TRPA1過度表達(dá)相關(guān)。
　　第三部分、五味子木脂素對氧化應(yīng)激下A549細(xì)胞TRPV1、TRPA1受體基因表達(dá)的影響
　　研究目的：
　　研究A549細(xì)胞在H2O2氧化應(yīng)激損傷下咳嗽受體TRPV1以及TRPA1的表達(dá)情況。
　　研究方法：
　?、貯549細(xì)胞分為正常組、H2O2高濃度組、H2

17、O2中濃度組、H2O2低濃度組、2%香煙煙霧誘導(dǎo)組、NAC+高濃度H2O2組。NAC+高濃度H2O2組在H2O2干預(yù)前先使用100μmol/L的NAC干預(yù)1h。其他各組直接使用相應(yīng)干預(yù)物干預(yù)1h。干預(yù)完成后提取細(xì)胞總RNA對TRPV1、TRPA1基因進(jìn)行qPCR檢測。
　?、贏549細(xì)胞分為正常組、H2O2干預(yù)組、H2O2+五味子醇甲組、H2O2+五味子甲素組、H2O2+五味子醇乙組、H2O2+五味子乙素組、H2O2+NAC組，所

18、有藥物組在加入100mmol/LH2O2干預(yù)前先使用對應(yīng)100μmol/L藥物孵育1h，H2O2干預(yù)1h后，提取細(xì)胞總RNA對TRPV1、TRPA1基因進(jìn)行qPCR檢測。
　　研究結(jié)果：
　　①與正常組相比，使用100mM、50mM、25mM三種濃度的H2O2對A549細(xì)胞干預(yù)1h后，均可以使模型組TRPV1、TRPA1的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（p<0.05），TRPV1及TRPA1表達(dá)上調(diào)趨勢與H2O2干預(yù)有濃度依賴性；在使

19、用100μMNAC干預(yù)后，TRPV1以及TRPA1的表達(dá)與高濃度H2O2模型組相比均有顯著下降（p<0.05）。
　　②與正常組相比，模型組A549細(xì)胞中的TRPV1、TRPA1的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（p<0.05）；與模型組相比較，五味子甲素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素以及NAC預(yù)先干預(yù)1h后，再使用100mMH2O2干預(yù)1h，均可以使A549細(xì)胞TRPV1、TRPA1的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（p<0.05）。