葡激酶改造：定點(diǎn)突變與聚乙二醇修飾聯(lián)合應(yīng)用及初步功能驗(yàn)證.pdf

1、目的：通過(guò)對(duì)葡激酶蛋白（SAK，S）基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，然后在多種條件下對(duì)突變蛋白進(jìn)行聚乙二醇修飾，篩選出最優(yōu)修飾條件。并通過(guò)分子篩分離得到較高純度修飾蛋白,并對(duì)其生物活性進(jìn)行初步驗(yàn)證。
　　方法：根據(jù) S蛋白晶體結(jié)構(gòu)及抗原位點(diǎn)選擇突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)突變引物，將 S蛋白上選定的氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?；將突變質(zhì)粒通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化進(jìn) BL21(DE3)感受態(tài)，并利用經(jīng)典原核表達(dá)技術(shù)，在大腸桿菌中表達(dá)突變蛋白S-cys；利用離子親和層析、離子交

2、換層析、分子篩等方法分離純化目的蛋白；對(duì)目的蛋白在不同條件下進(jìn)行聚乙二醇修飾，觀察并評(píng)價(jià)修飾溫度、修飾時(shí)間、蛋白質(zhì)：修飾劑摩爾比等因素對(duì)修飾率的影響；二次分離，將修飾蛋白與未成功修飾蛋白分離開(kāi)來(lái)，得到較高純度的修飾蛋白 peg-S-cys，并通過(guò)纖維蛋白平板溶圈實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物栓塞模型的構(gòu)建初步對(duì)其生物活性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：①成功將選定氨基酸突變?yōu)榘腚装彼?。②原核表達(dá)、純化后得到了純度較高的S-cys蛋白。③在多種條件下對(duì)S-cys