轉(zhuǎn)錄因子RUNX1與KLF4相互作用及轉(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)t(821)白血病細(xì)胞生物學(xué)功能的影響；新型LSD1抑制劑JL1037的抗白血病作用及其機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 轉(zhuǎn)錄因子RUNX1與KLF4相互作用及轉(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)t(8;21)白血病細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　研究目的:實(shí)驗(yàn)室前期用組蛋白去乙?；敢种苿┍蕉∷徕c(PB)誘導(dǎo)t(8;21)白血病細(xì)胞系Kasumi-1分化、凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，RUNX1、KLF4和P57的表達(dá)水平明顯升高，且通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)三者之間可能存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系及蛋白質(zhì)相互作用。本研究旨在分析RUNX1、KLF4和P57之

2、間的相互作用關(guān)系，并通過體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討RUNX1、KLF4和P57在t(8;21)白血病細(xì)胞中的生物學(xué)功能。
　　研究方法:實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測(cè)PB處理Kasumi-1細(xì)胞后RUNX1、KLF4和P57的mRNA和蛋白表達(dá)變化。構(gòu)建包含RUNX1結(jié)合位點(diǎn)的KLF4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告質(zhì)粒和包含KLF4結(jié)合位點(diǎn)的P57啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析RUNX1、RUNX1-ETO對(duì)

3、KLF4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用以及KLF4對(duì)P57的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，并應(yīng)用Western Blot技術(shù)在蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證。免疫熒光共聚焦和免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4的共定位以及蛋白質(zhì)相互作用，明確具體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并進(jìn)一步探討PB能否抑制RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4的結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4結(jié)合對(duì)KLF4轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的影響。構(gòu)建RUNX1、KLF4

4、和P57的慢病毒表達(dá)載體，包裝病毒，感染Kasumi-1細(xì)胞，研究上述基因過表達(dá)對(duì)t(8;21)白血病細(xì)胞增殖、周期、凋亡和分化等生物學(xué)功能的影響。構(gòu)建KLF4和P57逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，包裝病毒，感染t(8;21)白血病小鼠的骨髓白血病細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分選陽性細(xì)胞，移植受體小鼠，研究KLF4和P57過表達(dá)對(duì)t(8;21)白血病小鼠發(fā)病率和生存期的影響。
　　研究結(jié)果:PB處理Kasumi-1細(xì)胞后，RUNX1、KLF4和P57的

5、mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高。RUNX1以劑量依賴性的方式激活KLF4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告質(zhì)粒，而RUNX1-ETO對(duì)KLF4啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活作用明顯減弱。KLF4對(duì)P57啟動(dòng)子/增強(qiáng)子報(bào)告質(zhì)粒亦存在劑量依賴性的激活作用。在細(xì)胞系中過表達(dá)RUNX1可以上調(diào)KLF4和P57的蛋白表達(dá);而過表達(dá)RUNX1-ETO對(duì)KLF4和P57的蛋白表達(dá)無明顯影響;過表達(dá)KLF4，P57的蛋白表達(dá)升高。RUNX1、RUNX1-ETO與K

6、LF4均存在蛋白質(zhì)相互作用，且共定位于細(xì)胞核內(nèi)。RUNX1通過RUNT同源結(jié)構(gòu)域(Runt homology domain，RHD)與KLF4結(jié)合，RUNX1-ETO除了通過RHD還通過ETO部分與KLF4結(jié)合。RUNX1-ETO競(jìng)爭(zhēng)性地抑制野生型RUNX1與KLF4的結(jié)合，組蛋白去乙?；敢种苿㏄B不影響RUNX1、RUNX1-ETO與KLF4的結(jié)合。RUNX1與KLF4結(jié)合促進(jìn)KLF4對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，而RUNX1-ETO與K

7、LF4結(jié)合對(duì)下游靶基因轉(zhuǎn)錄并無明顯的促進(jìn)作用。在t(8;21)白血病細(xì)胞中過表達(dá)RUNX1、KLF4和P57均能抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，此外，KLF4還具有誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化的生物學(xué)功能。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KLF4和P57過表達(dá)可以降低t(8;21)白血病小鼠的發(fā)病率。
　　研究結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)了t(8;21)白血病細(xì)胞系中RUNX1→KLF4→P57新的調(diào)控信號(hào)通路，RUNX1通過轉(zhuǎn)錄激活KLF4進(jìn)而激活P57

8、抑制t(8;21)白血病細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而當(dāng)RUNX1發(fā)生染色體易位形成RUNX1-ETO融合蛋白時(shí)，上述作用消失。此外，RUNX1還通過與KLF4發(fā)生蛋白質(zhì)相互作用，進(jìn)一步增強(qiáng)KLF4對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，上述作用可以被RUNX1-ETO競(jìng)爭(zhēng)性地抑制。本研究闡明了轉(zhuǎn)錄因子RUNX1與KLF4之間的作用關(guān)系以及RUNX1-ETO融合蛋白對(duì)這種作用關(guān)系的影響。
　　第二部分 新型LSD1抑制劑JL1037的抗

9、白血病作用及其機(jī)制研究
　　研究目的:組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1)在白血病中高水平表達(dá)且與預(yù)后不良相關(guān)，敲降LSD1的表達(dá)或藥物抑制LSD1的活性可以顯著降低白血病干細(xì)胞的集落形成能力，延長白血病小鼠的生存時(shí)間。因此，設(shè)計(jì)并合成高效低毒的LSD1抑制劑有望成為白血病治療的新策略。JL1037是一個(gè)高效、高選擇性、可逆性的新型LSD1抑制劑，本研究旨在探討該化合物在體外和體內(nèi)對(duì)于白血病細(xì)胞的殺傷作用以及相關(guān)分子機(jī)制。<

10、br>　　研究方法:實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)檢測(cè)LSD1在白血病細(xì)胞系和正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平，篩選高表達(dá)LSD1的細(xì)胞系用于后續(xù)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn);Western blot檢測(cè)JL1037對(duì)LSD1底物組蛋白H3K4、H3K9甲基化水平以及對(duì)組蛋白H3乙?；降挠绊?MTS法檢測(cè)JL1037對(duì)白血病細(xì)胞增殖能力的影響，用SPSS軟件計(jì)算半數(shù)抑制劑量(IC50);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)JL1037對(duì)細(xì)胞周期分布、細(xì)

11、胞凋亡的影響，瑞氏染色觀察不同濃度的藥物處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;Westernblot檢測(cè)JL1037處理后細(xì)胞周期蛋白(P21、P27、P57)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Caspase3、PARP)和BCL-2家族蛋白(BCL-2、BCL-XL、BAX)表達(dá)變化。構(gòu)建LSD1 shRNA慢病毒載體，包裝病毒，感染THP-1和Kasumi-1細(xì)胞，敲降LSD1的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證JL1037是否通過特異性作用于LSD1這一靶點(diǎn)發(fā)揮生物學(xué)功能。免

12、疫熒光染色和Western Blot檢測(cè)JL1037對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC-3Ⅱ表達(dá)和分布的影響，透射電鏡觀察JL1037處理后細(xì)胞內(nèi)自噬小體、自噬溶酶體的形成情況;將JL1037和自噬抑制劑氯喹(CQ)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;Ficoll法分離正常供者和AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，免疫磁珠法分選臍帶血CD34+造血干/祖細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)JL1037對(duì)上述細(xì)胞凋亡的影響，將JL1037與氯喹(CQ)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞

13、的凋亡情況。體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)使用共表達(dá)AML1-ETO和C-KITD816V的白血病小鼠模型，實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為三組，分別通過尾靜脈注射JL1037（2.5mg/kg.d、5mg/kg.d）和PBS進(jìn)行治療，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠體重及外周血白血病細(xì)胞比例的變化，記錄并比較各組小鼠的生存期有無差異。藥物毒性實(shí)驗(yàn)使用正常的C57 BL/6小鼠，尾靜脈注射PBS和JL1037(5mg/kg.d)，連續(xù)10天，給藥結(jié)束后處死小鼠，比較兩組小鼠器官重量和器官組

14、織學(xué)形態(tài)有無差異。
　　研究結(jié)果:LSD1 mRNA和蛋白在白血病細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于正常人骨髓單個(gè)核細(xì)胞，以Kasumi-1、K562和THP-1細(xì)胞最為顯著。JL1037處理THP-1和Kasumi-1細(xì)胞后，組蛋白H3K4的單、雙甲基化水平升高，呈現(xiàn)劑量依賴性，組蛋白H3K9的甲基化水平和組蛋白H3的乙?；綗o明顯變化。JL1037對(duì)THP-1和Kasumi-1細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，48h的IC50分別為(30

15、.3±2.22)μM和(19.42±3.02)μM。JL1037激活caspase依賴的細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)劑量依賴性，同時(shí)激活線粒體凋亡信號(hào)通路，表現(xiàn)為促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL表達(dá)下調(diào)。低劑量的JL1037阻滯細(xì)胞周期于S期，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期，相關(guān)機(jī)制研究表明JL1037上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P21和P57表達(dá)。LSD1敲降實(shí)驗(yàn)證實(shí)，JL1037通過作用于LSD1這一靶點(diǎn)

16、發(fā)揮生物學(xué)作用。細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JL1037處理后細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)水平顯著上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬小體和自噬溶酶體，自噬抑制劑氯喹(CQ)與JL1037聯(lián)合使用將進(jìn)一步促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡。同時(shí)，JL1037顯著促進(jìn)急性髓系白血病患者的原代細(xì)胞凋亡而對(duì)正常的造血細(xì)胞作用相對(duì)較弱。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，JL1037抑制t(8;21)白血病的進(jìn)展，顯著延長白血病小鼠的生存期，同時(shí)顯示出了一定程度的毒性作用。
　　研究結(jié)論:本