吡格列酮衍生物對(duì)小鼠3T3-L1細(xì)胞細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的:為了進(jìn)一步增強(qiáng)胰島素增敏劑的療效，同時(shí)降低其藥物副作用，以吡格列酮(pioglitazone)化學(xué)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)開發(fā)了吡格列酮衍生物(CQMUHS-03)。本課題以小鼠3T3-L1細(xì)胞為依托，觀察CQMUHS-03對(duì)3T3-L1細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)誘導(dǎo)分化的影響，并初步討論其可能的機(jī)制，為CQMUHS-03在Ⅱ型糖尿病中的治療應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)分別用含不同濃度(1×10-8mol/L～1×10-4mol/

2、L)藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)，于24、48、72h采用MTT法檢測(cè)藥物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響。(2)建立3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化模型，并在誘導(dǎo)0天時(shí)即加入不同濃度的藥物，分別于誘導(dǎo)分化的2、4、6、8天收集細(xì)胞，進(jìn)行油紅O染色，拍攝照片并測(cè)定570nm處光密度(OD)值，尋找有效的藥物干預(yù)濃度。(3)誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化，并在誘導(dǎo)0天時(shí)即加入藥物，待分化成熟，提取細(xì)胞總RNA，Real-time P

3、CR分析PPARγ基因表達(dá)。(4)誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化，同時(shí)加入藥物分別作用2、4、6、8天收集細(xì)胞，采用Western Blot方法測(cè)定藥物對(duì)PPARγ蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:(1)通過24、48、72h的MTT檢測(cè)，結(jié)果顯示CQMUHS-03對(duì)3T3-L1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。通過中效方程計(jì)算72h時(shí)CQMUHS-03的IC50值為3.33×10-4 mol/L，吡格列酮IC50值為2.91×10-4

4、 mol/L。與陰性對(duì)照組相比1×10-4，1×10-5mol/L濃度的CQMUHS-03對(duì)細(xì)胞抑制作用較強(qiáng)，存活率低，組間有顯著性差異(P＜0.05)。與陰性對(duì)照組相比1×10-4，1×10-5，1×10-6mol/L濃度的吡格列酮，對(duì)細(xì)胞有抑制作用，組間有顯著性差異(P＜0.05)。CQMUHS-03與吡格列酮組比較，1×10-5，1×10-6，1×10-7mol/L濃度時(shí)存活率高于吡格列酮組，組間有顯著性差異(P＜0.05)。(2

5、)油紅O染色測(cè)定結(jié)果顯示吡格列酮各濃度均促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，在誘導(dǎo)分化的2、4、6、8天油紅染色提取法所測(cè)得OD值均比陰性對(duì)照組高，其中1×10-5，1×10-6mol/L濃度的促分化作用有顯著性(P＜0.05)。相對(duì)的，CQMUHS-03對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化促進(jìn)作用不明顯，相對(duì)于陰性對(duì)照組，誘導(dǎo)第2、4、8天兩者無顯著性差異。第6天時(shí)，僅1×10-6mol/L濃度的促進(jìn)作用相對(duì)于陰性對(duì)照有顯著性差異(P＜0.0

6、5)。CQMUHS-03與吡格列酮相比促分化作用弱，在1×10-6、1×10-7mol/L濃度時(shí)2、4、6、8天所測(cè)得的OD值均顯示有顯著性差異(P＜0.05)。(3) Real Time-PCR檢測(cè)顯示誘導(dǎo)分化8天，吡格列酮組PPARmRNA表達(dá)上調(diào)5.12倍，CQMUHS-03組PPARγmRNA表達(dá)上調(diào)2.29倍，與陰性對(duì)照組相比組間有明顯差異(P＜0.05)，且CQMUHS-03的上調(diào)作用顯著低于吡格列酮(P＜0.05)。(4)

7、在3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化的2、4、6、8天，Western blot測(cè)定PPARγ蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的增加，PPARγ蛋白表達(dá)先增加后降低。CQMUHS-03相比于陰性對(duì)照組，PPARγ的表達(dá)增高，組間有顯著性差異(P＜0.05)。同時(shí)，CQMUHS-03與吡格列酮相比，2、4、6天測(cè)定的蛋白表達(dá)量較低，組間有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:(1) CQMUHS-03在1×10-6mol/L濃度以下對(duì)

8、3T3-L1細(xì)胞毒性較小，對(duì)正常前脂肪細(xì)胞增殖無明顯抑制， IC50值為3.33×10-4mol/L，相對(duì)于吡格列酮（IC50為2.91×10-4 mol/L）毒性較小。
　　 (2) CQMUHS-03對(duì)3T3-L1細(xì)胞促分化作用較弱，并且明顯弱于吡格列酮的促分化作用。
　　 (3) CQMUHS-03明顯上調(diào)3T3-L1細(xì)胞分化過程中PPARγmRNA的表達(dá)，但弱于吡格列酮的上調(diào)作用。
　　 (4) CQMU