大黃素治療小鼠病毒性心肌炎的分子機制研究.pdf

1、研究目的:
　　1.觀察大黃素在病毒性心肌炎(VMC)小鼠中的療效;
　　2.觀察大黃素調(diào)控TLR介導的心肌病理損傷的炎癥應答作用;
　　3.建立CVB3誘導的小鼠病毒性心肌炎模型，探討大黃素調(diào)控病毒感染引起心肌炎癥免疫應答的相關分子機制;
　　4.優(yōu)化VMC的治療策略，開拓大黃素的臨床應用價值。
　　研究方法:
　　選擇90只雄性4-6周齡的BALB/c小鼠，體重均在14-16g之間，按照隨機數(shù)字表

2、法隨機將小鼠分為三組，分別是A組:對照組，B組:模型組，C組:大黃素組，每組30只小鼠。A組:小鼠給予腹腔注射0.1ml不含病毒液的培養(yǎng)液。B組:小鼠腹腔注射0.1ml內(nèi)含1×102TCID50柯薩奇病毒B3的Eagle's液建立VMC模型，C組:建立VMC模型基礎上，大黃素灌胃給藥30mg/kg/d，1次/d，連續(xù)給藥14d;A、B組小鼠給予喂飼等量的蒸餾水，觀察小鼠的生存情況，記錄實驗期間小鼠死亡數(shù)目。于實驗開始后第7d每組處死5只

3、小鼠，取出心臟測定病毒滴度，將心臟剪碎后研磨，離心取上清液，稀釋成不同的濃度，取各種濃度（10-110-2，10-3，10-4，10-5，10-6）的稀釋液0.2ml，加入96孔板（Hela細胞），設置4個復孔，觀察細胞情況，病變孔:病變細胞＞50％，依據(jù)Reed-Muench法測定，采用lgTCID50。熒光定量PCR測定CVB3mRNA拷貝數(shù):提取心肌組織中病毒的總RNA，紫外分光光度法測定D260/D280比值(1.8-2.0)，

4、擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，重復測定3次，以相對表達量表示。然后分別在第7天、第14天每組抽取小鼠8只，處死解剖，取出心臟，經(jīng)固定、水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、石蠟切片制作、封片、HE染色等步驟制作小鼠心肌病理切片。HE染色觀察心肌病理形態(tài)學變化，并進行病理積分的計算。方法如下:做好的切片每一張均隨機選取5個高倍鏡視野，在高倍鏡視野下觀察并計算視野內(nèi)壞死區(qū)域的面積以及炎性細胞的浸潤面積所占整個視野面積的比值。0分:無病變;1分:病

5、變面積＜25％;2分:病變面積25％-50％;3分:病變面積51％-75％;4分:病變面積＞75％。
　　RT-PCR測定心肌組織TLR4mRNA，首先把心肌組織總的RNA提取出來，然后再將總RNA逆轉錄成cDNA。RT-PCR依據(jù)Trizol法操作，定量采用紫外分光光度計，將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，重復測定3次，以相對表達量表示:基因灰度值與B-actin灰度值比值。Western-blot法測定心肌炎癥因子、TLR4-

6、NF-kB、P38MAPK表達，ELISA檢測血清水平炎癥因子變化。
　　并進行乳鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)，取1天齡的新生乳鼠60只，均采取牽拉脊柱法處死，然后固定在泡沫板上;沿小鼠的左肋下緣逐漸將胸腔剪切開，充分暴露胸腔并找到心臟，用剪刀剪斷大血管和周圍組織，再用鑷子將心臟輕輕取出，把心室部分的心臟組織完全剪碎，用不含血清的培養(yǎng)液洗1～2遍之后，轉移入50ml離心管中;經(jīng)胰酶反復消化6次，取沉淀物重懸并在培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)后再進

7、行傳代與凍存。經(jīng)原代培養(yǎng)新生乳鼠的心肌細胞隨機分為了4組，分別是A組:對照組，B組:模型組，C組:大黃素組，D組:LPS+大黃素組。其中，A組不給予病毒液。B組:應用CVB3感染心肌細胞8h。C組:用大黃素100ug/ml預處理心肌細胞2h，再應用CVB3感染心肌細胞8h。D組:預先LPS激活心肌細胞病毒8h，再用大黃素100ug/ml進行阻斷2h。檢測TLR4、NF-kB及其下游關鍵因子IkBα及p65的蛋白水平變化。通過Wester

8、n-blot法測定炎癥因子、TLR4-NF-kB與相關分子如p-IkBα、p-p65的表達及TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1等因子的濃度。
　　研究結果:
　　1.與對照組比較，模型組心肌病理積分、心肌組織P38MAPK、TLR4mRNA表達明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，大黃素組死亡率、病毒滴度、CVB3mRNA拷貝數(shù)、心肌病理積分顯著降低(P＜0.05)，心肌組織P38MAPK、TLR4mRNA表達明顯

9、下調(diào)(P＜0.05)。
　　2.TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的血清濃度在模型組較對照組顯著升高，兩者有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05);而使用大黃素干預后，大黃素組小鼠血清濃度較模型組有明顯的降低，并且比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　3.TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的蛋白水平在模型組較對照組顯著升高，兩者有顯著的統(tǒng)計學差異(P＜0.05);而使用大黃素干預后，大黃素組小鼠的蛋白水平較模

10、型組有明顯的降低，并且比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　4.心肌細胞原代培養(yǎng)，使用病毒感染細胞組別中TLR4、NF-kB蛋白表達顯著升高，IkBα及p65的磷酸化水平也有明顯上調(diào);而使用大黃素預處理組別中，這些蛋白水平有了明顯的下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.使用TLR4激動劑LPS對細胞進行處理，發(fā)現(xiàn)在LPS+Emodin組，其炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β及MCP-1的濃度水平與模型組無

11、統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，而與大黃素組比較，則有明顯的升高。
　　研究結論:
　　1.在VMC的發(fā)病進程中，TLR4-NF-κB和TLR4-P38MAPK信號傳導途徑起關鍵性作用。
　　2.在VMC的發(fā)病進程中，炎癥反應始終存在，諸多免疫炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6、MCP-1等發(fā)揮了重要作用。
　　3.大黃素有治療小鼠病毒性心肌炎的作用，其分子機制:(1)大黃素通過下調(diào)TLR4、P38MAPK水平