簡介：分類號分類號S852授予學(xué)位單位代碼授予學(xué)位單位代碼10434學(xué)號號2016120269山東農(nóng)業(yè)大學(xué)全日制碩士專業(yè)學(xué)位論文不同分子生物學(xué)方法用于檢測雞傳染性貧血病毒時(shí)的比較研究COMPARISONOFDIFFERENTMOLECULARBIOLOGICALMETHODSFDETECTIONOFCHICKENINFECTIOUSANEMIAVIRUS2018年6月8日姓名姓名張玉標(biāo)張玉標(biāo)學(xué)位類別學(xué)位類別獸醫(yī)碩士獸醫(yī)碩士專業(yè)專業(yè)獸醫(yī)研究方向研究方向分子病毒學(xué)分子病毒學(xué)學(xué)院學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師趙鵬副教授副教授關(guān)于學(xué)位論文原創(chuàng)性和使用授權(quán)的聲明本人所呈交的學(xué)位論文，是在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行科學(xué)研究所取得的成果。對在論文研究期間給予指導(dǎo)、幫助和做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人或集體，均在文中明確說明。本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。本人完全了解山東農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留和使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留和按要求向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文紙質(zhì)本和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文，同時(shí)授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫，并向社會公眾提供信息服務(wù)。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定。論文作者簽名導(dǎo)師簽名日期

簡介：研究背景目前我國正逐漸步入老齡化社會由于高血壓、糖尿病、高脂血癥等相關(guān)疾病發(fā)病率的上升加之現(xiàn)代人們不合理的飲食結(jié)構(gòu)、不良的生活方式以及較大的精神壓力缺血性心血管疾病如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟、外周缺血性疾病的發(fā)病率逐年上升病死率、致殘率高不僅嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量而且給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。如今常規(guī)藥物治療、外科和經(jīng)皮介入血管重建術(shù)的快速發(fā)展使得大部分患者能夠正常的生活工作。然而仍有一部分患者術(shù)后出現(xiàn)再狹窄、微血管功能障礙或由于彌漫性或嚴(yán)重的病變不適于常規(guī)血管成形術(shù)而藥物治療不能有效控制癥狀。因此必須再尋求其他新的治療策略。上世紀(jì)90年代以來人們發(fā)現(xiàn)組織器官缺血時(shí)機(jī)體內(nèi)促血管生成相關(guān)因子的表達(dá)反應(yīng)性增加通過促進(jìn)缺血組織的血管新生加速側(cè)枝循環(huán)的建立從而改善血流灌注但自身代償往往不充分、不及時(shí)而給予外源性生長因子即“治療性血管新生”為缺血性疾病治療提供了新的思路是當(dāng)前國際上最熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。最早用于治療性血管新生的有血管內(nèi)皮生長因子VULARENDOTHELIALGROWTHFACTVEGF和成纖維細(xì)胞生長因子FIBROBLASTGROWTHFACTFGF。VEGF和FGF通過了Ⅰ期臨床試驗(yàn)但Ⅱ期臨床試驗(yàn)的結(jié)果卻不盡如人意。VEGF不能誘導(dǎo)功能成熟的血管形成出現(xiàn)血管滲漏、組織水腫等不良反應(yīng)；FGF治療可以促進(jìn)血管新生但部分患者出現(xiàn)蛋白尿。目前有關(guān)VEGF和FGF的臨床研究已經(jīng)停止。人們逐漸意識到血管新生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程單純針對某階段或應(yīng)用單一因子干預(yù)治療難以形成趨近生理狀態(tài)的成熟的新生血管。如何實(shí)現(xiàn)理想血管重建是血管新生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)近年來研究顯示低氧誘導(dǎo)因子1HYPOXIAINDUCIBLEFACT1HIF1是一個(gè)非常重要的核轉(zhuǎn)錄因子由Α和Β兩個(gè)亞基組成Α為其功能活性亞基。HIF1Α與Β結(jié)合后從胞漿轉(zhuǎn)位到核內(nèi)直接或間接調(diào)控多種下游靶基因涉及到血管生長、血管張力、糖代謝、紅細(xì)胞生成等多種病理生理改變。到目前為止已發(fā)現(xiàn)參與血管新生的30多種基因受HIF1Α的調(diào)控因此HIF1Α是血管新生的上游核心調(diào)控因子。臨床前期研究表明HIF1Α治療誘導(dǎo)的新生血管具有無明顯炎癥反應(yīng)、不滲漏、不引起組織水腫的特點(diǎn)從而形成生理功能完整的新生血管。因此HIF1Α是一個(gè)十分具有應(yīng)用前景的血管新生治療因子。然而HIF1Α在常氧下的半衰期很短5MIN即可全部降解。這是由于HIF1Α含有氧依賴降解區(qū)OXYGENDEPENDENTDEGRADATIONDOMAINODDDODDD區(qū)PRO402以及PR0564兩個(gè)脯氨酸殘基是否羥基化決定其蛋白穩(wěn)定性。常氧情況下PRO402和或PRO564被脯氨酸羥化酶PPROLYLHYDROXYLASEDOMAINPHD羥化后經(jīng)泛素途徑降解。低氧時(shí)該過程受到抑制HIF1Α不被降解因而變得穩(wěn)定。氧濃度除了對HIF1Α蛋白穩(wěn)定性調(diào)節(jié)以外更為重要的是對HIF1Α轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)。HIF1Α的C末端含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)CTRANSACTIVATIONDOMAINSCTKD常氧情況下CTAD803位點(diǎn)的天門冬酰胺ASN803被羥化可阻止HIF1Α與部分輔助激活因子如CBPP300的結(jié)合降低其轉(zhuǎn)錄活性。故即使蛋白穩(wěn)定的HIF轉(zhuǎn)位到核內(nèi)后因HIF1Α的CTADASN803羥化降低了激活下游靶基因的能力。低氧時(shí)該過程受到抑制不能有效的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)ASN803羥基反應(yīng)從而導(dǎo)致HIF1Α的高轉(zhuǎn)錄活性。在此基礎(chǔ)上本課題組將HIF1Α的ODDD區(qū)PRO402和PRO564以及CTAD區(qū)ASN803進(jìn)行了點(diǎn)突變并選擇具有可轉(zhuǎn)染非增殖細(xì)胞并且轉(zhuǎn)染效率高、無致瘤性、容易獲得高滴度等優(yōu)點(diǎn)的腺病毒作為基因載體成功構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的三突變型HIF1ΑADHIF1ΑTRIP使其在常氧不僅能穩(wěn)定表達(dá)而且具有高轉(zhuǎn)錄活性可以促進(jìn)下游血管生成因子的表達(dá)有利于誘導(dǎo)成熟的血管新生。盡管我們已驗(yàn)證了ADHIF1ΑTRIP高生物學(xué)活性并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了成功可望應(yīng)用于臨床但是腺病毒在溶液中理化性質(zhì)不穩(wěn)定、不耐熱通常需保存在含有冷凍保護(hù)劑的緩沖液中并于80℃儲存。由于運(yùn)輸必須在干冰上進(jìn)行、儲存冷鏈限制、使用前需要凍融等因素限制了其未來的臨床應(yīng)用。冷凍干燥是將含水物料低溫冷凍使之凍結(jié)然后在低溫、高真空條件下使冰轉(zhuǎn)變?yōu)樗魵獬プ杂伤龠M(jìn)行第二次干燥除去部分吸附于固體間隙中的結(jié)合水的干燥方法。其優(yōu)點(diǎn)和意義在于冰的升華帶走熱量使凍干整個(gè)過程保持低溫凍結(jié)狀態(tài)因此非常適用于熱敏具有生物活性藥品的干燥；真空狀態(tài)可以對藥品起到抗氧化的作用；而干燥后的物質(zhì)含水量非常少、重量輕有利于在04℃甚至室溫條件下保存和運(yùn)輸；使用方便加蒸餾水或生理鹽水制成溶液即可恢復(fù)到凍干前的狀態(tài)。在凍干過程以及儲存過程均存在影響藥品穩(wěn)定性的因素需要添加凍干保護(hù)劑而不同的物料由于其結(jié)構(gòu)和組分的差異凍干保護(hù)劑也不盡相同選擇合適的凍干保護(hù)劑是制備出高質(zhì)量凍干產(chǎn)品的關(guān)鍵。此外ADHIF1ΑTRIP用于基因治療需要通過實(shí)驗(yàn)考察凍干后ADHIF1ΑTRIP的生物學(xué)活性。目的篩選合適的凍干保護(hù)劑制備凍干ADHIF1ΑTRIP觀察其在04℃條件下保存長期穩(wěn)定性并且考察凍干后ADHIF1ΑTRIP的生物學(xué)活性為ADHIF1ΑTRIP將來臨床應(yīng)用提供劑型方面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1將重組腺病毒載體ADHIF1ΑTRIP、ADNULL以及ADLACZ在低代HEK293A細(xì)胞中進(jìn)行病毒擴(kuò)增；氯化銫濃度梯度離心透析純化；純化后提取病毒DNA進(jìn)行PCR檢測同時(shí)行基因測序進(jìn)行鑒定；終點(diǎn)稀釋法測定病毒滴度。2初選3組處方其組成WVA10％海藻糖、05％明膠、3％山梨醇B10％蔗糖、05％明膠、3％山梨醇；C5％海藻糖、5％蔗糖、05％明膠、3％山梨醇；按照上述保護(hù)劑分組的百分比要求加入到磷酸鹽緩沖液中分別與稀釋的ADHIF1ΑTRIP原液按11比例混合05ML西林瓶分裝以適當(dāng)凍干曲線進(jìn)行凍干。根據(jù)凍干后物理性狀、病毒滴度測定篩選凍干保護(hù)劑。進(jìn)行加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn)并在凍干后1天以及第3、6、12個(gè)月測定病毒滴度觀察凍干ADHIF1ΑTRIP熱穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。3ADLACZ以不同轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI轉(zhuǎn)染微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMVECS經(jīng)XGAL染色法測定重組腺病毒轉(zhuǎn)染效率。96孔板培養(yǎng)HMVECS凍干前ADHIF1ΑTRIP、凍干后ADHIF1ΑTRIP分別以最佳MOI轉(zhuǎn)染細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后第24487296120小時(shí)用MTS方法檢測測細(xì)胞增殖的情況。4分別在ADHIF1ΑTRIP凍干后1天、凍干后6月、凍干后12月時(shí)間點(diǎn)提取病毒DNA進(jìn)行PCR及PCR產(chǎn)物測序鑒定三突變型HIF1Α基因；并在上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)以ADHIF1ΑTRIP轉(zhuǎn)染HMVECS提取72小時(shí)蛋白進(jìn)行WESTERNBLOT檢測HIF1Α蛋白的表達(dá)及下游VEGF蛋白的表達(dá)與液體ADHIF1ΑTRIP加以比較。5應(yīng)用SPSS130統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析計(jì)量數(shù)據(jù)以X±S表示。凍干后不同保護(hù)劑組間ADHIF1ΑTRIP滴度比較采用單向方差分析方差齊時(shí)組間多重比較采用LSD法方差不齊時(shí)采用GAMESHOWELL檢驗(yàn)；各組凍干前后滴度比較采用單樣本T檢驗(yàn)。凍干后腺病毒加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn)、長期穩(wěn)定性試驗(yàn)所測得滴度、MTS測得吸光度值組間比較及組內(nèi)不同時(shí)間比較采用重復(fù)測量的方差分析多重比較采用LSD法；加速熱穩(wěn)定性試驗(yàn)同一時(shí)間點(diǎn)組間比較采用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)長期穩(wěn)定性試驗(yàn)、MTS測得吸光度值組間比較采用單向方差分析。P結(jié)果1在HEK293A細(xì)胞內(nèi)反復(fù)擴(kuò)增后獲得重組腺病毒ADHIF1ΑTRIP、ADNULL和ADLACZ經(jīng)氯化銫純化后終點(diǎn)稀釋法測得的滴度分別為126LGPFUML、112LGPFUML、103LGPFUML。提取ADHIF1ΑTRIP病毒DNAPCR檢測HIF1Α基因得到預(yù)期的380BP、460BP、214BP的目的片段且DNA測序結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。2以10％海藻糖、05％明膠、3％山梨醇保護(hù)劑制備的凍干腺病毒外觀呈白色餅塊狀殘余水分含量3ADLACZ以不同MOI轉(zhuǎn)染HMVECSXGAL染色結(jié)果顯示當(dāng)MOI為100PFUCELL時(shí)重組腺病毒的感染效率趨于穩(wěn)定均在75％以上。MTS檢測顯示液體ADHIF1ΑTRIP和凍干ADHIF1ΑTRIP對HMVECS增殖無顯著差異P005但均與空白對照組之間有顯著差異P4經(jīng)PCR及基因測序鑒定凍干后1天、6月、12月的腺病毒所攜帶的目的基因信息無丟失或變異；WESTERNBLOT結(jié)果顯示凍干后1天、6月、12月的ADHIF1ΑTRIP與液體ADHIF1ΑTRIP轉(zhuǎn)染HMVECS后HIF1Α蛋白以及VEGF蛋白表達(dá)量與相當(dāng)且均高于ADNULL組表達(dá)水平。結(jié)論1本課題組構(gòu)建的重組腺病毒載體ADHIF1ΑTRIP、ADNULL和ADLACZ擴(kuò)增后能獲得較高的滴度且轉(zhuǎn)染效率高為下一步實(shí)驗(yàn)提供了保證。2以合適的保護(hù)劑制備凍干ADHIF1ΑTRIP能達(dá)到較滿意的凍干效果。凍干后ADHIF1ΑTRIP在04℃條件下能夠長期穩(wěn)定保存。3凍干后ADHEF1ΑTRIP仍具有良好的促進(jìn)HMVECS增殖。4凍干能夠長期保持ADHIF1ΑTRIP的高生物活性。

簡介：A型流感病毒是引起流行性感冒的主要病原體，具有高度變異性，能夠感染人和多種動(dòng)物，常常引起流感大流行，造成嚴(yán)重的損失和傷亡。而其中的H5N1亞型具有高致病性，能夠跨種族傳播，引起了全球的廣泛關(guān)注與重視。A型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是其傳播與感染過程中的重要毒力因子，在感染細(xì)胞中有高水平的表達(dá)，能夠通過多種RNA蛋白相互作用和蛋白蛋白相互作用幫助病毒復(fù)制，阻止被感染細(xì)胞凋亡以及拮抗宿主的免疫系統(tǒng)進(jìn)攻。NS1蛋白全長包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是N端的RNA結(jié)合區(qū)（RBD），NS1通過該結(jié)構(gòu)域與病毒MRNA相互作用，調(diào)節(jié)病毒特異性蛋白的翻譯，從而增強(qiáng)病毒的復(fù)制另一個(gè)是C端的效應(yīng)區(qū)ED，NS1通過該結(jié)構(gòu)域和其他蛋白相互作用來阻斷宿主Ⅰ型干擾素IFN的組裝，抑制干擾素誘導(dǎo)蛋白的激活，從而逃避或拮抗宿主的免疫系統(tǒng)。同時(shí)，NS1蛋白能夠與多種其他蛋白相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號通路的傳導(dǎo)，如NS1能夠與CRK家族蛋白相互作用激活PI3K信號通路?？梢钥闯?，NS1作為一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，對流感病毒的毒性起著至關(guān)重要的作用。因此解析H5N1亞型NS1蛋白全長的晶體結(jié)構(gòu)以及其與相互作用蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)對于我們進(jìn)一步了解A型流感病毒的致病機(jī)制具有重要意義，為研究開發(fā)更有效的流感病毒抑制劑提供結(jié)構(gòu)生物學(xué)依據(jù)。本課題中我們通過分子克隆技術(shù)，將NS1蛋白的全長野生型基因序列和突變型基因序列構(gòu)建到原核表達(dá)載體PGEX4T1和PET28A中。采用原核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)可溶的目的蛋白，提取后采用親和層析和凝膠排阻層析對目的蛋白進(jìn)行純化，獲得高純度高濃度的目的蛋白，最后通過蒸汽擴(kuò)散法對目的蛋白進(jìn)行結(jié)晶條件的初篩。同時(shí)，進(jìn)行了NS1蛋白與CRKⅠ蛋白的相互作用復(fù)合物的純化實(shí)驗(yàn)。

簡介：目的H3N2型流感病毒常不定期的引起不同程度的爆發(fā)流行，因該病毒的高變異性，目前的疫苗株對已發(fā)生抗原突變的病毒株不能產(chǎn)生有效的保護(hù)。通過對2010～2015年杭州地區(qū)甲型流感H3N2進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，實(shí)現(xiàn)對該病毒菌株的分子變化進(jìn)行監(jiān)測，并為疾病的防控提供可靠的科學(xué)證據(jù)。方法12010年1月至2015年9月浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)相關(guān)數(shù)據(jù)，各年度流感樣病例分別為2406例、995例、766例、1156例、1928例和404例。分別采用研究試劑所有病例的咽拭子均分離到H3N2流感病毒，并經(jīng)過血凝抑制實(shí)驗(yàn)和流感病毒核酸監(jiān)測證實(shí)。2參考ANEWYK3922004H3N2毒株，設(shè)計(jì)擴(kuò)增H3N2各個(gè)片段的全編碼區(qū)序列引物，通過PCR的方法對疑似患者進(jìn)行擴(kuò)增測序3序列收集所有H3N2的HAHEMAGGLUTININ與NANEURAMINIDASE基因完整序列均在GISAID及NCBI上搜索查找獲取。在GISAID數(shù)據(jù)庫上搜索關(guān)鍵詞分別為“H3N2”，“ASIA”，“CHINA”，“HANGZHOU”，“HA”或“H3N2”，“EUROPE”，“SWITZERL”“HA”“H3N2”“NTHAMERICA”“UNITEDSTATES”“TEXAS”“HA”“H3N2”，“OCEANIA”，“AUSTRALIA”，“VICTIA”，“HA”在NCBI數(shù)據(jù)庫中的“NUCLEOTIDE”中搜索“H3N2”，“HA”，“NA”，并查找“HANGZHOU”4HA與NA基因序列篩選與比對依據(jù)病毒的分離地、時(shí)間、宿主為前提條件進(jìn)行整合，條件相同序列只取一條。H3N2基因序列按照地區(qū)分為杭州及WHO推薦的20132015年流行疫苗株ATEXAS502012H3N2、20132014年流感疫苗株AVICTIA3612011和20152016疫苗株ASWITZERL97152932013E53作為參考毒株的HA和NA兩組。分組的序列分別用軟件CLUSTALXV18進(jìn)行比對、分析、剪切對齊。序列比對完成后，直接運(yùn)用MEGAV52軟件，采用NEIGHBJOING法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。用FIGTREE軟件對圖形進(jìn)行編輯。結(jié)果12010～2015年杭州地區(qū)H3N2亞型的核酸陽性人數(shù)分別為73、42、40、33、62、30，H3N2亞型核酸陽性率分別為303％、422％、567％、285％、377％、434％。22010～2015年杭州地區(qū)H3N2感染率分析，不同年度間H3N2感染率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義X226266，P＜005，不同性別和年齡組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義X27168，X212954P＞005。32015年HA序列分析結(jié)果表明，該年度沒有形成新的病毒。4通過對2010～2013年的NA序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列高度保守。結(jié)論2010～2015年杭州甲型流感病毒H3N2占流感總陽性的469％，且絕大多數(shù)的病毒株屬于3C組。每年的冬春季節(jié)為杭州市H3N2流感流行期。由于3C2和3C3A病毒株間很少有抗原交叉，因此分支3C3A中疫苗株ASWITZERL97152932013參考株可能無法提供針對流行組3C2病毒所需的保護(hù)。2015年1月～9月病毒株研究結(jié)果顯示，2015年分離株抗原決定簇在A區(qū)和B區(qū)有多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了變異，雖未形成新的亞型，但其他位點(diǎn)的變異正在加強(qiáng)。本文對2010年～2013年杭州H3N2亞型流感病毒NA基因的序列進(jìn)行測定，該基因的進(jìn)化路徑主要是以一進(jìn)化主干伴隨著多側(cè)支的方式進(jìn)化。但2012～2013年的毒株在進(jìn)化樹上沒有循序漸進(jìn)的過程，進(jìn)化呈現(xiàn)跳躍的方式，同一年代毒株可分為幾個(gè)分支同時(shí)存在，這些分支在進(jìn)化樹上的位置有高有低，進(jìn)化中由于免疫壓力和病毒自身進(jìn)化因素的影響，某些分支會成為進(jìn)化的主流。以往研究表明，NA的酶活性中心氨基酸是病毒和受體相互作用的主要因素，該中心位點(diǎn)序列是高度保守的，與病毒的繁殖能力有著直接的關(guān)系。本研究也證實(shí)了NA的酶活性中心位點(diǎn)是高度保守的。作為NA抑制劑藥物作用的位點(diǎn)，它的保守也意味著杭州2010～2013年間在基因序列上沒有發(fā)現(xiàn)耐藥毒株。

簡介：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文一株H3N2亞型犬流感病毒的分離鑒定及其生物學(xué)特性的研究姓名張旭申請學(xué)位級別碩士專業(yè)獸醫(yī)學(xué)；臨床獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師王洪斌20110620ABSTRACTISOLATIONANDCHARACTERIZATIONOFANH3N2CANINEINFLUENZA碭而SABSTRACTCANINEINFLUENZAISAHIGHLYINFECTIOUSVIRALDISEASECAUSEDBYCANINEINFLUENZAVIRUSBELONGINGTOSUBTYPEH3N2ANDH3N8UPTONOWWEDON’TKNOWWHETHERHUMANBEINGSANDOTHERMAMMALSAREINFECTEDWITHCANINEVIRUS，WHOSENATURALHOSTS，DOGSARECONSIDEREDASHUMANBEING’SCLOSESTFRIENDFORTHEPREVENTIONANDCONTROLOFCANINEINFLUENZA，ITISIMPORTANTTOMAKECLEARTHEBIOLOGICALCHARACTERISTICSOFCANINEINFLUENZAVIRUSOURSTUDIESFOCUSEDONZ『H3N2AH3N2CANINEINFLUENZAVIRUSISOLATEDFROMADEADTIBETANMASTIFFBOUGHTFROMADOGEXHIBITIONINZHEJIANGPROVINCE，CHINAWECOMPAREDTHENUCLEOTIDESEQUENCEOFALLTHEEIGHTGENESEGMENTSOFZJH3N2WITHOTHERSREFERENCEVIRUSINGENEBANK，NLERESULTSINDICATEDTHATTHESEQUENCEOFALLEIGHTGENESOFZJH3N2WEREHIGHLYHOMOLOGOUSTOKOMAH3N2INFLUENZAVIRUSESKOREA07ANDGUANGDONGH3N2INFLUENZAVIRUSESGD07DOGINFECTIONSTUDIESSHOWEDTHATARTIFICIALLYINFECTEDDOGSAPPEAREDSANLECLINICALSYMPTOMSASNATURALLYINFECTEDDOGSALLDOGSINFECTEDSHOWEDDEPRESSION，LOSTOFAPPETITE，HIGHFEVERANDCOUGHTWODOGSWEREEUTHANIZED4DAYSPOSTINFECTIONANDTISSUESWERECOLLATEDFORHISTOPATHOLOGICALSTUDYANDVIRALISOLATIONTHEHISTOPATHOLOGIEALTESTSHOWEDTHATLUNGHADOBVIOUSLYINFLAMMATORYEXUDATIONANDHEMORRHAGEVIRALTITERSINLUNGTISSUESGOTTO1047SEID50／GNEREMAININGINFECTEDDOGSRECOVEREDWITHOUTANYTREATMENTTHECANINEINFLUENZAVIRUSCOULDTRANSMITFROMDOGTODOGBYAIRANDTHEDOGSGOTFEVER4DAYSPOSTCONTACTANDAPPEAREDSIMILARSYMPTOMSASINFECTEDDOGSINORDERTOKNOWWHETHEROTHERANIMALSWEREINFECTEDWITHZJH3N2WBUSEDBALB／CMICEGUINEAPIGANDDUCK嬲THEANIMALMODELSNEMICEBEGANTOLOSTWEIGHTAFTER2DAYSINFECTEDWITH106EIDS0ZJH3N2VIRUSZJH3N2VIRUSCOULDREPLICATEINTHENASALTISSUE，TRACHEAANDLUNGSOFMICEBUTDIDNOTKILLMICEZJH3N2VIRUSCOULDREPLICATEINNASALTISSUEOFGUINEAPIGWHILENOVIRUSWASRECOVEREDFROMANYTISSUEOFDUCKS4DAYSAFTERTHEANIMALSWEREINFECTEDWITHIO。EIDS0ZJH3N2‘INSUMMARYWEISOLATEDANDIDENTIFIEDALLH3N2CANINEINFLUENZAVIRUSANDITSBIOLOGICALCHARACTERISTICSWERESTUDIEDINDETAILTHERESULTSHOWEDTHATZJH3N2V_IIUSHIGHLYHOMOLOGOUSTOKOMAH3N2INFLUENZAVIRUSESKOREA07ANDGUANGDONGH3N2INFLUENZAVIRUSESGD07，WHICHWEREORIGINALLYCOMEFROMAVIANINFLUENZAVIRUSTHISSTUDYALSOPROVEDTHATZJH3N2COULDREPLICATEINOTHERMAMMALSBESIDESDOGS，BUTNOTINDUCKSTHERESULTCOMPLEMENTEDTHEKNOWLEDGEOFEPIDEMIOLOGYOFCANINEINFLUENZAVIRUS，ANDSUPPLYMATERIALANDTHEANIMALMODELFORTHESTUDIESOFINTERSPECIESTRANSMISSIONOFINFLUENZAVIRUSN

簡介：目錄目錄IULLIILLHILLLLILULIIILLLULY2772202摘要?????????????????????????????????????????????I英文摘要?????????????????????????????????III1引言?????????????????????????????????????????L1．1本研究課題的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析???????????????11．1．1雞馬立克氏病和雞馬立克氏病病毒??????????????????11．1．2BIDV的傳播及感染??????????????????????????21．1．3LVIDV基因組及致瘤基因???????????????????????31．1．4IVIDV的進(jìn)化及機(jī)制????????????????????????71．2本研究課題的目的和意義???????????????????????102材料和方法??????????????????????????????112．1實(shí)驗(yàn)材料?????????????????????????????112．1．1病毒株、血清和單抗???????????????????????112．1．2主要試劑??????????????????????????????????1L2．1．3主要耗材????????????????????????????112．1．4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?????????????????????????????1L2．1．5儀器???????????????????????????????????????122．2實(shí)驗(yàn)方法???????????????????????????????122．2．1MD的流行病學(xué)及MDV與其他免疫抑制病毒的混感調(diào)查?????????122．2．2MDV野毒株分離與鑒定??????????????????????．142．2．3MDV野毒株MEQ基因序列測定及分析????????????????152．2．4MDV野毒株致病性分析??????????????????????．152．2．5MDVREV分離物致病性分析????????????????????172．2．6分離物CYMR中MDV的BAC克隆的構(gòu)建???????????????182．2．7分離物CYMR中MDV的BAC克隆的基因組序列測定??????????182．2．8統(tǒng)計(jì)分析????????????????????????????193結(jié)果與分析??????????????????????????????．213．1MDV的流行病學(xué)及其與其他免疫抑制病毒的混感調(diào)查????????????213．1．1MD的檢測????????????????????????????????????2L3．1．2MDV與REV、ALV和CIAV的混合感染????????????????213．1．3MDV與REV、ALV和CIAV的多重感染情況??????????????223．2MDV野毒株與MDVREV分離物的分離與鑒定??????????????．223．2．1MDV野毒株的分離與鑒定?????????????????????．223．2．2MDVREV分離物的分離與鑒定???????????????????253．3MDV野毒株MEQ基因序列測定和分析??????????????????263．3．1MDV分離株MEQ基因序列分子特征?????????????????26COBRN強(qiáng)RRSCONTENTSABSTRACT???????????????????????????????????????????一IABSTRACTINENGLISH。????????‘??????????????????III1INTRODUCTION????????????????????????????????????????L1．1RESEARCHPROGRESSOFMDV???????????????????????????????’L1．1．1MDANDMDVRESEARCHBACKGROUND?????????????????????????”L1．1．2ⅣDVTRANSMISSIONANDINFECTION???????????????????????????21．1．3GENOMEOFMDV??????????????????????????????????一31．1．4MDVEVOLUTIONANDTHEFUNDAMENTALMECHANISMSOFDRIVINGVIRUSEVOLUTION?????‘71．2THEGOALANDTHEMEANINGOFTHEEXPERIMENT???????????????????????102MATERIALSANDMETHODS??????????????????????????????????1L2．1MATERIALS???????????????????????????????????????112．1．1VIRUS，SERUMANDMCAB???????????????????????????????112．1．2MAINREAGENTS????????????????????????????????????112．1．3MAINCONSUMABLES?????????????????????????????????一112．1．4EXPERIMENTALANIMALS????????????????????????????????112．1．5INSTRUMENT?????????????????????????????????????122．2METHODS????????????????????????????????????????122．2．1THEEPIDEMIOLOGYOFMDVANDPOLYINFECTIONWITHIMMUNOSUPPRESSIVEVIRUSES????‘122．2．2SEPARATIONANDDETECTIONOFMDVANDMDVREVISOLATES??????????????‘142．2．3SEQUENCEANALYSISOFMEQGENEOFMDVISOLATES???????????????????152．2．4PATHOGENICITYOFMDVISOLATES???????????????????????????’152．2．5PATHOGENICITYOFMDVREVISOLATES????????????????????????一172．2．6CONSTUCTIONOFⅣDVBACOFCYMR????????????????????????一182．2．7GENOMEANALYSISOFMDVBACOFCYMR??????????????????????182．2．8DATAANALYSISANDPROCESSING????????????????????????????‘193RESULTSANDANALYSIS’‘213．1THEEPIDEMIOLOGYOFMDVANDPOLYINFECTIONWITHIMMUNOSUPPRESSIVEVIRUSES?????’213．1．1DETECTIONOFMDV?????????????????????????????????一213．1．2POLYINFECTIONOFMDVWITHREV,ALVANDCAV???????????????????213．1．3DOUBLE，TRIPLEORQUARINFECTIONOFMDVWITHREVALVANDCAV??????‘223．2SEPARATIONANDDETECTIONOFMDVANDMDVREVISOLATES???????????????‘223．2．1SEPARATIONANDDETECTIONOFMDVISOLATES??????????????????????‘223．2．2SEPARATIONANDDETECTIONOFMDVREVISOLATES???????????????????253．3SEQUENCEANALYSISOFMEQGENEOFM【DVISOLATES?????????????????????263．3．1MOLECULARCHARACTERIZATIONOFMEQGENEOFMDVISOLATES???????????????26III

簡介：分類號②必33㈧969㈧75Y孝中震聾夫?qū)W密級／’，博士學(xué)位論文PHDDISSERTATION核盤菌弱毒菌株AHL6所含真菌病毒及其生物學(xué)特性研究MOLECULARANDBIOLOGICALCHARACTERIZATIONOFTHEMYCOVIRUSESINSCLEROTINIASCLEROTIORUMHYPOVIRULENTSTRAINAHL6研究生CANDIDATE冉鴻昌RANHONGCHANG蠡UDE凈NT．083010NO10006STUD．1UUUU專業(yè)MAJOR植物病理學(xué)PLANTPATHOLOGY導(dǎo)師姜道宏教授SUPERVISORPROFESSORJIANGDAOHONG中國武漢WUHAN，CHINA二。一七年十二月DEC，2017華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)書學(xué)位論文舀如需保密，解密時(shí)間年月日是否保密獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得華中農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料，指導(dǎo)教師對此進(jìn)行了審定。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中做了明確的說明，并表示了謝意。研究生簽躺帆廬礦見月習(xí)曰學(xué)位論文使用授權(quán)書校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存提交論文的印刷版和電子版，猁橢晰為期張妻魏簽名曰期勿77年J‘互月孑曰．簽名日期．2EJ7午L2．月冒日|

簡介：密級論文編號中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文L型鴨肝炎病毒中國流行株生物學(xué)特性相關(guān)研究MOLECULARCHARACTERISTICSOFDUCKHEPATITISVIRUS1ISOLATEDINCHINA博士研究生劉曉麗指導(dǎo)教師孔憲剛研究員申請學(xué)位類別農(nóng)學(xué)博士專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向動(dòng)物病毒分子生物學(xué)及分子免疫學(xué)培養(yǎng)單位中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院哈爾濱獸醫(yī)研究所提交日期2011年6月中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文評閱人、答辯委員會簽名表論文題目I型鴨肝炎病毒中國流行株生物學(xué)特性相關(guān)研究動(dòng)物病毒分子生物學(xué)及分子論文作者劉曉麗專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向免疫學(xué)指導(dǎo)教師孔憲剛研究員培養(yǎng)單位研究所、中心哈爾濱獸醫(yī)研究所姓名職稱碩博單位專業(yè)簽名碩導(dǎo)口＼評博導(dǎo)口閱碩導(dǎo)口‘＼博導(dǎo)口人＼碩導(dǎo)口博導(dǎo)口放R1辯碩導(dǎo)口磚廡L主李慶章教授東北農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)席博導(dǎo)■碩導(dǎo)口鋤移厶翁長江研究員哈爾濱獸醫(yī)研究所預(yù)防獸醫(yī)學(xué)博導(dǎo)一碩導(dǎo)口／勁于力研究員哈爾濱獸醫(yī)研究所預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。博導(dǎo)一放您弛口碩導(dǎo)口中科院昆明動(dòng)物研究張華堂研究員博導(dǎo)一所預(yù)防獸醫(yī)學(xué)辯扈榮良教授碩導(dǎo)口序羞分委博導(dǎo)■軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)華育平教授碩導(dǎo)口鐋口博導(dǎo)■東北林業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)貝碩導(dǎo)口澮炊涂長春教授軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)博導(dǎo)■碩導(dǎo)口一J／／博導(dǎo)口會議記錄秘書王永強(qiáng)論文答辯時(shí)間地點(diǎn)2011年6月14同哈爾濱獸醫(yī)研究所學(xué)術(shù)報(bào)告廳

簡介：在病毒性疫苗的研究開發(fā)工作中，人二倍體細(xì)胞作為病毒抗原的制備基質(zhì)是整個(gè)疫苗研發(fā)及生產(chǎn)質(zhì)量控制的首要選擇。對作為疫苗制備基質(zhì)的人二倍體細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性及其病毒感染生物學(xué)反應(yīng)特征的相關(guān)分析，將為病毒疫苗的研究及開發(fā)包括疫苗安全性的研究提供更為豐富的資料。從細(xì)胞生物學(xué)的角度看，細(xì)胞特定酶學(xué)反應(yīng)特征被認(rèn)為可以反映細(xì)胞的遺傳學(xué)特性和生物學(xué)性狀?，F(xiàn)有的資料表明，當(dāng)細(xì)胞面臨病毒感染時(shí)，其具有天然免疫反應(yīng)性質(zhì)的生物學(xué)反應(yīng)事實(shí)上是與其自身的生物學(xué)性狀相關(guān)的。其中細(xì)胞所產(chǎn)生的干擾素反應(yīng)，在病毒疫苗制備技術(shù)工藝上又是一個(gè)具有重要意義的質(zhì)量指標(biāo)，而該指標(biāo)與細(xì)胞增殖過程中的生物學(xué)活性狀態(tài)具有直接的相互聯(lián)系。因此，分析細(xì)胞酶活性特征與其在病毒感染時(shí)的干擾素反應(yīng)強(qiáng)度，顯然對這類細(xì)胞用于疫苗制備時(shí)的技術(shù)研究具有重要的意義。因此本文采用多種細(xì)胞系，多代細(xì)胞，通過生化方法檢測細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、琥珀酸脫氫酶的酶活力變化以鑒定細(xì)胞的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，人胚肺二倍體細(xì)胞（KMB17細(xì)胞）和新型的人胚肺二倍體細(xì)胞（N0細(xì)胞）在細(xì)胞代次超過30代后，細(xì)胞內(nèi)的酶活力會發(fā)生一定的變化，乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶的酶活力上升，超氧化物歧化酶的酶活力下降，表明這兩種細(xì)胞在細(xì)胞代次超過30代后，細(xì)胞的增殖、代謝等能力會下降，細(xì)胞穩(wěn)定性較差，不利于用于疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)。VERO細(xì)胞和HELA細(xì)胞隨著細(xì)胞代次增加酶活力無明顯變化，表明這兩種細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)所采用的細(xì)胞代次內(nèi)，細(xì)胞的增殖、代謝等能力基本保持穩(wěn)定。本文重點(diǎn)分析了各種酶活性指標(biāo)的變化與細(xì)胞在RNA病毒和DNA病毒感染時(shí)所產(chǎn)生的干擾素反應(yīng)的相互聯(lián)系，以及這些相互聯(lián)系所導(dǎo)致的病毒感染滴度的變化情況。做為在細(xì)胞核內(nèi)完成增殖和在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)完成增殖的HSV1病毒和EV71病毒感染人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17、N0時(shí)，其引起IFNΑ的相對表達(dá)量與細(xì)胞的酶活力、細(xì)胞的生長狀態(tài)有很大的關(guān)系。當(dāng)人胚肺二倍體細(xì)胞培養(yǎng)到第3天時(shí)，細(xì)胞酶活力處于上升階段，細(xì)胞的生長狀態(tài)較好，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到第5天時(shí)，細(xì)胞酶活力處于穩(wěn)定狀態(tài)，細(xì)胞的生長狀態(tài)也維持相對穩(wěn)定，兩種病毒感染培養(yǎng)到第5天細(xì)胞引起細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量比感染培養(yǎng)到第3天細(xì)胞引起細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量高，而病毒滴度在感染過程中逐漸上升，但隨著干擾素分泌的增加而其增殖逐漸變低的事實(shí)，提示了人二倍體細(xì)胞在病毒增殖過程中所具有的容納限度，可能與干擾素的產(chǎn)生濃度相關(guān)。當(dāng)兩種病毒感染培養(yǎng)到第3天和第5天的HELA細(xì)胞時(shí)，其引起細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量與細(xì)胞的酶活力關(guān)系不大，且比感染其他種類細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量低，這提示了該細(xì)胞作為一種腫瘤細(xì)胞的非限制型特征。反之，兩種病毒感染培養(yǎng)到第3天的VERO細(xì)胞引起細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量比感染培養(yǎng)到第5天細(xì)胞引起細(xì)胞分泌的IFNΑ的相對表達(dá)量高，且病毒滴度前者也高于后者。這一特征有別于人二倍體細(xì)胞，似乎提示了VERO細(xì)胞的生物學(xué)特性，這些通過研究病毒感染后引起細(xì)胞分泌的IFNΑ相對表達(dá)量的變化與細(xì)胞酶活力、細(xì)胞生長狀態(tài)之間的關(guān)系的工作，雖然這需要進(jìn)一步的確證和分析，但相關(guān)的數(shù)據(jù)將又為疫苗的研究和制備提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

簡介：目的慢性乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV感染是全球性的公共衛(wèi)生問題，目前大約有4億人為慢性感染，每年因HBV感染所致相關(guān)肝病死亡的患者大約有100萬人，其感染可引起一系列肝臟疾病，包括慢性乙型肝炎CHRONICHEPATITISB，CHB、肝硬化LIVERCIRRHOSIS，LC和肝細(xì)胞癌HEPATOCELLULARCARCINOMA，HCC等?？共《局委熓荂HB患者最為根本也是最為重要的治療。抗病毒治療的短期目標(biāo)是抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制，對于HBEAGHEPATITISB“E”ANTIGEN陽性的CHB患者同時(shí)需要獲得HBEAG血清學(xué)轉(zhuǎn)換。長期目標(biāo)就是減慢或阻止肝臟疾病向LC、HCC方向發(fā)展，提高患者的生活質(zhì)量和患者的生存率。目前，抗HBV的藥物主要有兩類，一類是注射用的干擾素制劑，另外一種是口服核苷（酸）類藥物NUCLEOSTIDENNALOGUES，NAS。NAS是乙型肝炎病毒HBVRNA依賴性DNA多聚酶的抑制劑，可以直接抑制病毒的復(fù)制，從而降低體內(nèi)的病毒水平。NAS由于是口服藥，每日一次服用，與注射用干擾素相比，使用比較方便，且安全性好，適合長期使用。在中國，目前可以選擇的口服NAS藥物有五種，包括拉米夫定LAM、阿德福韋酯ADV、恩替卡韋ETV、替比夫定LDT和替諾福韋酯TDF。隨著口服核苷類藥物在臨床實(shí)踐中的廣泛使用，越來越多的臨床問題亟待解決。例如患者對長期抗病毒治療的接受程度及依從性問題、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、長期治療的副作用問題、育齡期患者的生育安全問題以及長期服用帶來的耐藥性問題等。迄今為止，還沒有確切的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)可以科學(xué)地指導(dǎo)NAS抗HBV治療的合理療程，同時(shí)也缺乏一個(gè)可靠的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)來指示是否可以停藥或何時(shí)停藥。療程問題是困擾患者和臨床醫(yī)生的重要問題，也是影響患者依從性的主要障礙。雖然，歐洲及美國肝病指南推薦HBSAG發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換后可以考慮停藥，但核苷（酸）類藥物治療發(fā)生HBSAG血清學(xué)轉(zhuǎn)換的機(jī)率是極低的。事實(shí)上，這一推薦也難在臨床上廣泛應(yīng)用，其中的原因之一是按目前指南標(biāo)準(zhǔn)停藥，停藥后復(fù)發(fā)率較高，原因之二就是指南本身的推薦意見尚缺乏高質(zhì)量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。此外，NAS雖然能有效地抑制HBV的復(fù)制，但是由于其不能清除肝細(xì)胞內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（COVALENTLYCLOSEDCIRCULARDNA，CCCDNA）。正因?yàn)槿绱?，很多患者在停藥后很快出現(xiàn)病毒復(fù)制，甚至出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)。雖然NAS何時(shí)能夠停藥仍然飽受爭議，但是卻是臨床上非常關(guān)注的一個(gè)問題。因此，有必要尋找和探索有關(guān)停藥后預(yù)測復(fù)發(fā)的臨床指標(biāo)，盡可能將停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降到最低。為此我們展開了本次前瞻性研究，目的是為了尋找和探索預(yù)測停藥后持久應(yīng)答的指標(biāo)，尋求最佳停藥終點(diǎn)以降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。方法本次研究是一項(xiàng)前瞻性、單中心、觀察性研究，入組的都是亞洲CHB患者（HBSAG陽性＞6月），停藥時(shí)病毒都得到了很好的控制并且自愿停藥進(jìn)入隨訪觀察。入組的患者都來自南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院門診或住院患者，所有入組分析的患者停藥隨訪時(shí)間都至少達(dá)到了6個(gè)月。計(jì)量單位采用均數(shù)±SD或中位數(shù)和四分位間距IQR表示，計(jì)數(shù)單位采用百分比表示。對于數(shù)值變量我們采用的是X2檢驗(yàn)，對于連續(xù)性變量酌情采用T檢驗(yàn)或曼惠特尼檢驗(yàn)。多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析可以預(yù)測研究終點(diǎn)的相關(guān)因素。為了研究在初次HBVDNA＞2000IUML的HBVDNA水平對生物化學(xué)復(fù)發(fā)的預(yù)測因素，我們采用了伴時(shí)COX回歸模型分析，對于第一次HBVDNA上升的時(shí)間定義為T0。持續(xù)性HBVDNA上升作為一個(gè)伴時(shí)變量進(jìn)行分析，允許患者從非持續(xù)HBVDNA上升轉(zhuǎn)換到持續(xù)性HBVDNA上升組。結(jié)果一、入組人群截止到2015年7月，總共有87例患者滿足了停藥標(biāo)準(zhǔn)并且簽訂了停藥協(xié)議進(jìn)入停藥隨訪研究，并且停藥時(shí)間至少6個(gè)月。其中有5例患者停藥時(shí)HBSAG為陰性，沒有納入本次分析。共有82例停藥時(shí)HBSAG陽性并且HBVDNA陰性的患者納入了本次分析。入組的82例停藥患者中，男性患者73例，女性患9例。其中既往有使用過NAS藥物的有19例，初次NAS治療的有63例。此外，既往有干擾素治療史的患者有18例。本次停藥患者中，使用一線抗病毒藥物ETV的患者有32例，使用二線抗病毒藥物（NONETV，包括LAM、ADV、LDT和LAMADV）有50例。停藥患者的平均年齡為35±84歲，抗病毒治療時(shí)間的中位數(shù)為40年（四分位間距2540），鞏固治療時(shí)間的中位數(shù)為23年（四分位間距1439）。在開始NAS治療前，60例73％為HBEAG陽性患者，22例27％為HBEAG陰性患者。治療前為HBEAG陽性與治療前為HBEAG陰性的患者的人口學(xué)數(shù)據(jù)和臨床特點(diǎn)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，只有停藥時(shí)患者的年齡和鞏固治療時(shí)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療前為HBEAG陽性患者平均年齡為34±81歲，要小于治療前HBEAG陽性患者的40±78歲P0002治療前HBEAG陰性患者鞏固治療時(shí)間中位數(shù)為29年（四分位間距1851），明顯的要大于治療前為HBEAG陽性患者的21年（四分位間距1235）P0043。本次分析納入的82例停藥隨訪患者依從性良好，只有2例患者失訪，失訪的時(shí)間分別為24周和60周。對于沒有發(fā)生臨床復(fù)發(fā)的患者，隨訪時(shí)間的中位數(shù)為19年（四分位間距1425）。二、病毒學(xué)復(fù)發(fā)及預(yù)測因素在停藥隨訪過程中，總共有58例患者發(fā)生了病毒學(xué)復(fù)發(fā)。對于治療前為HBEAG陽性的患者，停藥后05年、1年和2年的累積病毒學(xué)復(fù)發(fā)率分別為65％、69％和73％，而對于治療前為HBEAG陰性的患者停藥后05年、1年和2年的累積病毒學(xué)復(fù)發(fā)率分別為55％、64％和77％，兩組患者之間的累積病毒學(xué)復(fù)發(fā)率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P086。COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析顯示只有治療藥物是病毒學(xué)復(fù)發(fā)的相關(guān)因素。多因素分析中，使用二線抗病毒藥物NONETV發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)可能性是使用一線抗病毒藥物ETV的2倍HR196，95％CI107359，P0028。停藥2年時(shí)，停藥前使用ETV與NONETV治療的患者累積病毒學(xué)復(fù)發(fā)率分別為6460％和8027％，兩者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P00135。三、臨床復(fù)發(fā)及預(yù)測因素停藥隨訪中，共有28例患者發(fā)生臨床復(fù)發(fā)，其中有16例57％患者臨床復(fù)發(fā)時(shí)ALT＞5ULN。對于治療前為HBEAG陽性的患者，停藥后05年、1年和2年的累積臨床復(fù)發(fā)率分別為14％、26％和31％對于治療前為HBEAG陰性的患者停藥05年、1年和2年的累積臨床復(fù)發(fā)率分別為14％、27％和53％。HBEAG陽性與HBEAG陰性兩組之間的累積臨床復(fù)發(fā)率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P0099。四、生物化學(xué)復(fù)發(fā)的預(yù)測因素停藥隨訪過程中總共有58例患者發(fā)生過病毒學(xué)復(fù)發(fā)。在這58例患者之中，有31例患者發(fā)生了生物化學(xué)復(fù)發(fā)，停藥2年時(shí)累積生物化學(xué)復(fù)發(fā)率為65％。對于停藥后持續(xù)性HBVDNA≤2000IUML的24例患者，在停藥隨訪時(shí)間的中位數(shù)為2年（四分位間距為1325）的過程中沒有一例患者發(fā)生了生物化學(xué)復(fù)發(fā)。結(jié)論1本次研究表明NAS停藥后，病毒學(xué)復(fù)發(fā)是非常普遍的。COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析示抗病毒藥物是病毒學(xué)復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，使用一線抗病毒藥物ETV治療的患者停藥后發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)低。2治療前HBEAG的狀態(tài)對停藥后的病毒學(xué)復(fù)發(fā)及臨床復(fù)發(fā)沒有影響。3多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析發(fā)現(xiàn)只有年齡是臨床復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，HBSAG雖然不是臨床復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，但是停藥時(shí)HBSAG≤200IUML的患者發(fā)生臨床復(fù)發(fā)的可能性更小。4停藥2年的FIBROSCAN及肝臟超聲檢測結(jié)果表明患者停藥后沒有肝臟組織學(xué)進(jìn)展。5停藥后HBVDNA水平以及持續(xù)性HBVDNA上升是生物化學(xué)復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。由于停藥后存在極高的生物化學(xué)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，對于停藥后HBVDNA上升超過200000IUML的患者應(yīng)該直接進(jìn)行抗病毒治療，無論患者的ALT水平是否超過了2倍的正常上限ULN對于停藥后HBVDNA水平在2000200000IUML之間，同時(shí)伴有ALT＞2ULN的患者，為了防止進(jìn)一步的肝臟損害，應(yīng)該再次行抗病毒治療對于HBVDNA水平在2000200000IUML之間，而ALT≤2ULN的患者，可以在13個(gè)月內(nèi)再次檢測HBVDNA，如果HBVDNA依然超過2000IUML（持續(xù)性HBVDNA上升），由于存在較高的生物化學(xué)復(fù)發(fā)率，應(yīng)該再次行抗病毒治療，如果HBVDNA＜2000IUML可以繼續(xù)隨訪觀察。

簡介：分類號河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文論文題目英文題目密級ISOLATIONANDIDENTIEI￡蘭豎QNQ里PORCINEPARVOVIRUSA墜嬰王墜至豎S羔墮ITSB10LOGICALCHARA￡基RS衛(wèi)￡S學(xué)位申請人題』蟲導(dǎo)師王刖迭專業(yè)亟隨獸醫(yī)堂研究方向動(dòng)物籩鎏痘蕉痘扭理壁隨圭論文提交日期學(xué)位授予日期定一一鑒一L一蠱一金一的一一掛宜猛丑南一掛河一堂壹塑病一生一羞緗一㈤糊必本論文受到下述項(xiàng)目資助國家高技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃863項(xiàng)目NO2007AAL00606

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