PML-NBs蛋白細(xì)胞內(nèi)防御機(jī)制研究和克隆一種新的Bax異構(gòu)體.pdf

1、本論文首先探討了PML-NBs作為細(xì)胞內(nèi)防御系統(tǒng)在對抗外界干擾如整合酶以及病毒感染過程中發(fā)揮的作用，并選擇了噬菌體整合酶ΦBT1和腺病毒分別作為抗整合和抗病毒研究的對象。
　　噬菌體整合酶ΦBT1因其具有可介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)特異性整合的能力而成為了基因治療中一種潛在的工具，它豐富了轉(zhuǎn)基因載體的選擇，并使得多位點(diǎn)特異性整合成為可能。研究中發(fā)現(xiàn)，ΦBT1整合酶中四個(gè)氨基酸433RFAL436對整合酶與PML-NBs蛋白Daxx的結(jié)合起到了

2、關(guān)鍵作用。通過進(jìn)一步構(gòu)建并利用ΦBT1整合酶哺乳動(dòng)物細(xì)胞報(bào)告系統(tǒng)，我們證實(shí)了過表達(dá)Daxx會(huì)抑制ΦBT1整合酶在293T細(xì)胞中的重組效率。本研究首次報(bào)道了細(xì)胞內(nèi)的蛋白可以與ΦBT1整合酶發(fā)生相互作用并抑制其重組活性。該結(jié)果對于改善ΦBT1整合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因操作以及選擇ΦBT1整合酶靶細(xì)胞方面具有重要的參考意義。
　　E1B55K是腺病毒的早期蛋白，可與p53相互作用并介導(dǎo)p53的降解。p53的失活對促進(jìn)腺病毒DNA復(fù)制具有重要意義

3、。先前的研究表明，腺相關(guān)病毒AAV可通過保護(hù)p53不被E1B55K介導(dǎo)的泛素化途徑降解來削弱腺病毒的轉(zhuǎn)化能力，但是具體細(xì)節(jié)并不清楚。在本研究中，我們通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了腺相關(guān)病毒蛋白Rep78與p53之間的相互作用，并證實(shí)Rep78可抑制E1B55K對p53的胞質(zhì)輸出和降解。Rep68不能和p53結(jié)合，且對E1B55K的抑制作用較弱。但Rep78不能消除E1B55K與p53的結(jié)合，對應(yīng)的，p53的轉(zhuǎn)錄激活活性也不能得到恢復(fù)。此外，被

4、Rep78保留在細(xì)胞核內(nèi)的p53從均勻分布變化為了顆粒狀的分布，而后者與PML-NBs蛋白的經(jīng)典分布模式類似，提示PML-NBs可能參與了該過程。該研究結(jié)果為Rep78，以及PML-NBs對抗腺病毒的模型提出了新的可能。
　　其次我們把目光投向了Bcl-2家族蛋白Bax。Bcl-2家族蛋白是程序性細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵作用的調(diào)控因子，并按包含Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-4）的不同劃分為三大類。按其功能，Bcl-2家族蛋白可分為抗凋亡蛋

5、白和促凋亡蛋白兩種。Bax是具有多個(gè)BH結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，并在凋亡途徑中起到關(guān)卡的作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)并克隆到了一種新的Bax的異構(gòu)體Bax-ω，其與異構(gòu)體Bax-β相比具有相同的C末端但缺失了N端的78個(gè)氨基酸。盡管Bax-ω缺乏了BH3結(jié)構(gòu)域，但仍可引發(fā)強(qiáng)烈的凋亡。而其與Bax-β所共有的，與其他異構(gòu)體不同的C端對其促凋亡活性具有一定的影響。表達(dá)譜分析顯示Bax-ω在多種正常組織中都存在表達(dá)。我們的結(jié)果表明Bax-ω是一種新