氫氣生物學(xué)效應(yīng)系列研究.pdf

1、氫是自然界最簡(jiǎn)單的元素，氫氣是無(wú)色、無(wú)嗅、無(wú)味、具有一定還原性的雙原子氣體。氫氣的溶解度比較低，且不能被機(jī)體大量吸收，所以，人們一直沒(méi)有重視氫在高等生物體內(nèi)的作用。在輻射化學(xué)領(lǐng)域，曾有人證明在溶液中氫氣可與羥自由基直接反應(yīng)（Jphys Chem.1988），但這沒(méi)有受到生物學(xué)家重視?？茖W(xué)家曾試圖證明高壓情況下，氫氣或許可與氧或高活性自由基發(fā)生反應(yīng)，但研究并沒(méi)有獲得該反應(yīng)存在的直接證據(jù)（Undersea Hyperb Med. 1994）

2、。因此，大部分生物學(xué)家一直認(rèn)為，氫氣屬于生理性惰性氣體。2007年國(guó)際上首次報(bào)道，動(dòng)物呼吸2％的氫可有效治療腦缺血再灌注損傷。繼而，我們前期實(shí)驗(yàn)研究率先發(fā)現(xiàn)，腹腔注射含氫鹽水也能非常有效治療新生大鼠缺血缺氧性腦損傷。雖然選擇性抗氧化是氫治療作用的可能機(jī)制，但在機(jī)體內(nèi)氫的具體作用機(jī)制尚不清楚，氫氣對(duì)其它缺血損傷是否具有類(lèi)似的保護(hù)作用亦未知。因此，本課題先后采用3種不同的損傷模型（心肌缺血再灌注損傷，氧中毒肺損傷和一氧化碳遲發(fā)型腦損傷），尋

3、找氫氣選擇性抗氧化作用的在體依據(jù)及可能機(jī)制，從而為進(jìn)一步深入研究氫氣治療缺血性疾病的內(nèi)在機(jī)制，開(kāi)發(fā)利用氫作為臨床藥物，評(píng)價(jià)氫的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)。
　　 目前，血管再通、恢復(fù)血流是治療急性心肌梗死（acute myocardiAlinfarction, AMI)臨床上最有效和普遍的手段。盡管恢復(fù)血流非常關(guān)鍵，呼吸爆發(fā)可以激發(fā)ROS的產(chǎn)生從而導(dǎo)致細(xì)胞毒作用。 活性氧的大量產(chǎn)生不可避免的驅(qū)動(dòng)了細(xì)胞壞死和凋亡相關(guān)的信號(hào)通路的激活，此為

4、致死性再灌注損傷。50％以上的最終梗死面積歸因于再灌注損傷，因此減少再灌注損傷是保護(hù)心肌的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本課題在于證實(shí)簡(jiǎn)單易用、安全和經(jīng)濟(jì)的氫飽和生理鹽水對(duì)于心肌缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用。我們通過(guò)評(píng)估注射氫飽和生理鹽水24小時(shí)后心肌梗死面積、氧化應(yīng)激水平和心功能，對(duì)機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　 氧中毒急性肺損傷（Hyperoxic acute lung injury, HALI）是由長(zhǎng)時(shí)程的高濃度氧吸入引起（氧分壓超過(guò)50％）

5、。目前認(rèn)為，高分壓氧引起活性氧增加，驅(qū)動(dòng)氧化損傷是氧中毒的關(guān)鍵因素。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，氫是一種新的抗氧化物質(zhì)，可以有效減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。因此，本課題采用大鼠慢性氧中毒模型，氫飽和生理鹽水注射，肺臟損傷指標(biāo)以及相關(guān)氧化指標(biāo)和炎癥指標(biāo)的測(cè)定，研究氫對(duì)氧中毒的影響，以期初步明確氫的作用機(jī)制，為防治氧中毒提供新的手段和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 一氧化碳（CO）中毒是目前困擾全球毒理學(xué)家、重癥監(jiān)護(hù)醫(yī)生、急癥醫(yī)生最常見(jiàn)的毒性氣體損傷導(dǎo)致的疾

6、病之一。CO中毒的臨床癥狀經(jīng)常是非特異性、多種多樣的。超過(guò)半數(shù)的存活者在CO中毒后的3天到4周內(nèi)會(huì)發(fā)生認(rèn)知障礙。CO中毒的病理生理過(guò)程與低氧、興奮性氨基酸上升和氧化應(yīng)激相關(guān)。中性粒細(xì)胞、線(xiàn)粒體和黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的活性氧簇引起脂質(zhì)過(guò)氧化，最終導(dǎo)致遲發(fā)型神經(jīng)損傷的發(fā)生。本研究的目的旨在驗(yàn)證氫氣治療減少CO遲發(fā)型腦病的推測(cè)，評(píng)估氫氣治療大鼠嚴(yán)重急性CO中毒腦病的有效性
　　 第一部分、氫飽和生理鹽水對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用<

7、br>　　 方法：
　　 1、采用大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支暫時(shí)阻斷30min，之后恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血供復(fù)灌注24 h的方法建立大鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型。
　　 2、再灌注24 h后，經(jīng)右頸總動(dòng)脈插入PE導(dǎo)管檢測(cè)大鼠左心室心功能參數(shù)。
　　 3、再灌注24 h后，1％TTC，37 oC, 心肌切片染色15 min并固定，檢測(cè)大鼠心肌梗死面積。
　　 4、蘇木精－伊紅染色（H&E）對(duì)心肌進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)分。<

8、br>　　 5、取心肌缺血區(qū)組織勻漿標(biāo)本和血漿標(biāo)本，進(jìn)行丙二醛（MDA）含量檢測(cè)，檢測(cè)心肌缺血區(qū)組織Caspase-3水平的表達(dá)。
　　 6、免疫組化檢測(cè)8羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤（8-OHdG）的表達(dá)和分布，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡的情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、與缺血再灌注組和缺血再灌注+生理鹽水注射組相比，再灌注5分鐘前單次腹腔注射氫飽和生理鹽水（5ml/Kg）可以明顯改善心肌缺血再灌注損傷引起的心功能下降

9、（P<0.05)。
　　 2、氫水治療可以明顯較少心肌梗死面積 （P<0.05),組織學(xué)分析顯示氫水治療組心肌缺血區(qū)細(xì)胞壞死和出血顯著減少，TUNEL染色顯示心肌細(xì)胞凋亡數(shù)減少。
　　 3、氫水治療組心肌缺血區(qū)組織和血漿中氧化損傷指標(biāo)MDA明顯減少，凋亡酶Caspase-3在心肌缺血組織中表達(dá)亦減少 （P<0.05)。
　　 4、氫水治療可以降低再灌注損傷引起的DNA損傷指標(biāo)8-OHdG的表達(dá)。
　　 第

10、二部分、氫飽和生理鹽水對(duì)氧中毒肺損傷的預(yù)防作用
　　 方法：
　　 1、建立大鼠慢性氧中毒模型（氧艙持續(xù)暴露60h，98％純氧吸入）
　　 2、檢測(cè)肺臟濕干比和胸膜腔滲出液含量，肺組織切片HE染色觀察肺臟形態(tài)學(xué)改變。
　　 3、檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA和SOD在肺臟組織勻漿中的表達(dá)。
　　 4、ELISA法檢測(cè)肺組織TNF-a、IL-1b、MPO和8-OHdG的表達(dá)。
　　 5、TUNEL染

11、色檢測(cè)肺臟細(xì)胞凋亡的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、氫氣可以有效預(yù)防氧中毒肺損傷，減少肺臟濕干比和胸膜腔滲出液，肺組織切片HE染色提示氫氣治療可明顯減少肺水腫、充血、肺泡內(nèi)出血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　 2、SOD、MDA和8-OHdG在氫氣治療組表達(dá)量均減少，提示氫氣治療可以有效減少氧化應(yīng)激。
　　 3、氫氣治療可以有效減少肺臟中TNF-a、IL-1b和MPO的表達(dá)。
　　 4、TUNEL染色提示氫氣

12、治療組相比對(duì)照組和生理鹽水組肺泡上皮和內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減輕。
　　 第三部分、氫飽和生理鹽水對(duì)一氧化碳中毒遲發(fā)型腦病的治療作用
　　 方法：
　　 1、建立大鼠CO中毒模型，大鼠在動(dòng)物艙內(nèi)持續(xù)40min吸入1000ppm濃度 CO，之后20min持續(xù)吸入3000ppm濃度CO至昏迷后出艙。
　　 2、CO中毒后9天，經(jīng)主動(dòng)脈灌流4％多聚甲醛固定大鼠，取腦， 尼氏染色檢測(cè)皮層和海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變。<

13、br>　　 3、免疫熒光方法檢測(cè)腦中小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況（Iba1的表達(dá)水平）,免疫組化檢測(cè)髓磷脂基礎(chǔ)蛋白 (MBP)在皮層和海馬中的表達(dá)。
　　 4、ELISA法檢測(cè)大腦組織TNF-a、IL-1b、MPO和8-OHdG的表達(dá)。
　　 5、Morris水迷宮檢測(cè)認(rèn)知功能在不同處理組的差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、與對(duì)照組相比，氫氣治療組皮層和海馬CA1區(qū)尼氏陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。
　　 2、氫氣治療

14、可以有效減少CO中毒后腦中小膠質(zhì)細(xì)胞抗原Iba1的表達(dá)，同時(shí)氫氣治
　　 療組MBP降解亦減少。
　　 3、氫氣治療組大腦海馬和皮層中TNF-a、IL-1b、MPO和8-OHdG的表達(dá)相比對(duì)照組明顯降低。
　　 4、通過(guò)水迷宮檢測(cè)，提示氫氣治療可以明顯改善CO中毒導(dǎo)致的認(rèn)識(shí)功能障礙。
　　 小 結(jié)
　　 1、氫飽和生理鹽水可以顯著提高大鼠缺血損傷后心功能的恢復(fù)。此種作用可能與氫氣的自由基清除作用有