家蠅和日本沼蝦硫氰酸生成酶基因功能研究.pdf

1、家蠅(Musca domestica)屬于節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱雙翅目蠅科蠅屬,廣泛分布于陸地各處。日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)屬于節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱十足目長臂蝦科沼蝦屬,俗稱青蝦、河蝦,廣泛分布于中國、日本、東南亞和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)的淡水河湖中。本文以陸生昆蟲家蠅和水生甲殼動(dòng)物日本沼蝦為材料研究和比較其硫氰酸生成酶的功能。本研究共分以下4個(gè)部分:
　　(1)以本實(shí)驗(yàn)室前期研究獲得的1條家蠅硫氰酸生成酶基因的

2、氨基酸序列作為query sequence,利用tBlastn程序在家蠅轉(zhuǎn)錄組和日本沼蝦轉(zhuǎn)錄組中查找其同源序列。隨后使用BlastX、SMART和ORF Finder程序?qū)Λ@得的序列進(jìn)行分析,最后確定了家蠅的5條序列和日本沼蝦的3條序列為硫氰酸生成酶樣基因,并命名為Md-Rho1-5和Mn-Rho1-3。使用CLC Main Workbench5軟件對獲得的序列和其他物種的硫氰酸生成酶、巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶和HSP67B2基因的氨基酸序列

3、進(jìn)行同源比對和進(jìn)化樹構(gòu)建,明確了硫氰酸生成酶之間的分子進(jìn)化關(guān)系。
　　(2)成功構(gòu)建了6種原核表達(dá)載體。獲得了4種可溶性表達(dá)的重組蛋白rMd-Rho1、rMd-Rho4、rMn-Rho1和rMn-Rho2,并且均具有硫氰酸生成酶活性。還獲得2種包涵體形式存在的重組蛋白rMd-Rho2和rMd-Rho3,經(jīng)過變性復(fù)性過程之后,這2種重組蛋白也表現(xiàn)出了硫氰酸生成酶活性。
　　(3)利用GST pull down技術(shù)篩選了與硫氰酸

4、生成酶相互作用的蛋白質(zhì),結(jié)果顯示1條80 kD左右的差異條帶,但質(zhì)譜鑒定未能明確是何種蛋白。
　　(4)利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對Md-Rho3、Md-Rho4和Mn-Rho1、Mn-Rho2基因的表達(dá)模式進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)Md-Rho3、Mn-Rho1、Mn-Rho2基因在細(xì)菌刺激后上調(diào)表達(dá),而Md-Rho2在刺激后下調(diào)表達(dá)。組織定量結(jié)果顯示Md-Rho3主要在家蠅血細(xì)胞中表達(dá)而Md-Rho4主要在家蠅腸道中表達(dá),Mn-Rho1主要分布