玉米細(xì)胞質(zhì)HSC70的純化及其與鈣調(diào)素結(jié)合特性研究.pdf

1、用ATP-瓊脂糖親和層析柱和DEAE-52離子交換術(shù)從懸浮培養(yǎng)的玉米細(xì)胞中純化了胞質(zhì)HSC70;1mMCa<'2+>下,生物素標(biāo)記鈣調(diào)素凝膠覆蓋實驗首次檢測到CaM能與玉米HSC70結(jié)合,但以5mM EGTA代替1mMCa<'2+>時,HSC70不能與CaM結(jié)合,說明HSC70與CaM的結(jié)合是Ca<'2+>依賴性的.已知NAD激酶(NADK)為植物細(xì)胞中依賴CaM的激酶,NADK活性測定表明玉米HSC70在一定范圍內(nèi)能競爭性抑制依賴于C

2、aM的NADK的活性.通過實驗證明鈣調(diào)素能抑制HSC70的ATP酶活性,以上事實證實植物中HSC70為一CaM結(jié)合蛋白.根據(jù)動物HSC70分子中與CaM結(jié)合的一段氨基酸序列比較可知,玉米、番茄、豌豆、擬南芥等HSP70的HSC分子的N端ATP結(jié)合位點附近都有一段高度保守的由21個氨基酸組成的序列,分析可能是CaM結(jié)合區(qū)域,人工合成了這段21個氨基酸的小肽.通過實驗證明,該小肽能抑制依賴于CaM的PDE酶的活性;適量的CaM存在下,隨著小

3、肽加入量的增加,可抑制PDE酶活性至基礎(chǔ)活性;該小肽還能抑制依賴于CaM的NADK的活性.1mM Ca<'2+>下,純化的CaM與小肽在25℃下反應(yīng)一段時間,進(jìn)行10﹪的聚丙烯酰胺凝膠天然電泳,結(jié)果顯示:同單獨(dú)的CaM相比,與小肽結(jié)合后的CaM遷移率發(fā)生明顯改變.表明人工合成的HSC70中的CaM結(jié)合序列能與CaM結(jié)合.總之,所有的試驗都說明玉米胞質(zhì)HSC70為鈣調(diào)素結(jié)合蛋白,而且鈣調(diào)素與HSC70的結(jié)合位點在HSC70的N端的ATP結(jié)