銀杏雌雄花芽差異表達(dá)基因研究.pdf

1、銀杏原產(chǎn)中國(guó)，有世界“金色活化石”之稱，為典型的雌雄異株植物，適應(yīng)性強(qiáng)，種植范圍廣泛，集材、果、藥、觀賞多功能于一體，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)供不應(yīng)求。銀杏雌雄株的生長(zhǎng)習(xí)性、形態(tài)特征與用途各不相同，雄株常用作綠化中的行道樹，而雌株則以果實(shí)的生產(chǎn)為主要目的。銀杏雌雄株的選擇往往受制于童期長(zhǎng)、性別分化和性別表現(xiàn)較遲的影響，在其生長(zhǎng)早期不能正確地區(qū)分。因此，準(zhǔn)確的鑒定銀杏性別，在生產(chǎn)實(shí)踐中意義重大。二十世紀(jì)以來(lái)，隨著分子生物

2、學(xué)及生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，已利用遺傳標(biāo)記對(duì)銀杏的性別決定及遺傳機(jī)制有了一些了解，但有關(guān)性別基因的確定及調(diào)控機(jī)理方面的研究少見報(bào)道，利用分子生物學(xué)的方法分離性別相關(guān)基因仍需大量的研究工作。抑制差減雜交(SSH)技術(shù)因其假陽(yáng)性率低、高效靈敏、經(jīng)濟(jì)速度、重復(fù)性好等特點(diǎn)，近年來(lái)已作為一種高效便捷鑒別差異表達(dá)基因的方法，取得許多研究成果，并已廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)及定向克隆的研究中?；谝陨显?，本研究應(yīng)用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)及實(shí)時(shí)定量分析等方法技

3、術(shù)，分別以銀杏雌、雄花芽為材料，構(gòu)建銀杏雌雄花芽抑制性差減文庫(kù)，通過對(duì)差減cDNA文庫(kù)所包含的所有序列進(jìn)行生物信息學(xué)功能注釋和分類，篩選與銀杏性別調(diào)控相關(guān)的ESTs，繼而對(duì)這些ESTs進(jìn)行表達(dá)分析及檢測(cè)。集中研究這些ESTs在銀杏雌雄株花器官發(fā)育中的差異表達(dá)，為進(jìn)一步探討銀杏雌雄株性別分化的機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)，也為后續(xù)銀杏花發(fā)育相關(guān)基因的克隆、表達(dá)和功能分析工作打下基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　⑴應(yīng)用SSH技術(shù)成功構(gòu)建了銀杏雌雄花芽

4、差異表達(dá)的正反向兩個(gè)差減cDNA文庫(kù)，文庫(kù)片段插入率接近95％，插入片段的大小主要分布在300-1300bp之間，平均長(zhǎng)度在750bp左右。差減文庫(kù)的成功構(gòu)建為進(jìn)一步篩選及克隆與銀杏性別相關(guān)的基因奠定了基礎(chǔ)，對(duì)銀杏性別鑒定研究的分子機(jī)制具有重要意義。
　?、评肗CBI網(wǎng)站BLASTn軟件，將銀杏雌雄花芽差減文庫(kù)篩選得到的差異基因ESTs片段序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，獲得的功能注釋序列通過GO分類體系進(jìn)行初

5、步生物信息學(xué)分析。結(jié)果雌花芽?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)序列中有23.91％得到了同源序列，雄花芽?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)序列中有58.42％比對(duì)得到了同源序列，總體超過半數(shù)的差異表達(dá)EST序列沒有獲得功能注釋，參與光合作用、能量代謝等的保守基因序列占10％左右，同源基因獲取率低。
　?、菍⒉町惢駿STs與本實(shí)驗(yàn)室之前的銀杏葉片RNA-seq測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后，再一次提交BLASTn比對(duì)，結(jié)果顯示，超過80％的序列獲得了功能注釋，明顯提高了同源基因獲取率。得到的

6、雌雄花芽差異ESTs按照生物學(xué)功能分類共分為:功能未知、能量代謝、光合作用、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白質(zhì)代謝和折疊、脂代謝、次生代謝、氨基酸代謝、細(xì)胞壁重塑、細(xì)胞骨架重塑、轉(zhuǎn)運(yùn)、抗性與逆境相應(yīng)、糖代謝、核苷酸代謝和細(xì)胞周期與細(xì)胞生長(zhǎng)，共16類。其中，核苷酸代謝為雌花芽特有，細(xì)胞周期與細(xì)胞生長(zhǎng)為雄花芽特有。雌、雄花芽共有14個(gè)功能類別，說明同樣作為花器官的前體和旺盛生長(zhǎng)的組織，雌雄花芽在基因表達(dá)和代謝狀態(tài)上具有一定的相似性，同時(shí)也存在特異性

7、。由此可見，銀杏雌雄花芽發(fā)育過程中，伴隨著復(fù)雜多樣的生理生化過程。
　?、炔顪p文庫(kù)中篩選到8個(gè)可能控制植物花器官發(fā)育及配子體形成相關(guān)基因的ESTs，如Dof家族轉(zhuǎn)錄因子通過抑制CO基因的轉(zhuǎn)錄可以延遲擬南芥植株開花;CRT蛋白參與某些植物花柱道的發(fā)育和雙受精過程;PAE通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的代謝，參與植物花粉發(fā)育過程;PLD具有促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)展的作用，參與植物花粉管極性生長(zhǎng)等過程;PAL基因的突變會(huì)造成花粉活力喪失;SHEPHERD基因的突變

8、會(huì)抑制花粉管的極性伸長(zhǎng)等。另外，從差減文庫(kù)中篩選到5類激素相關(guān)基因，如Beta-葡糖苷酶能夠活化CTK分子;ETH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)序列;DWARF基因負(fù)責(zé)GA的合成等。這些ESTs功能的分析和驗(yàn)證，為分析銀杏雌雄花基因的表達(dá)，以及進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究調(diào)控花的發(fā)育奠定基礎(chǔ)。
　?、蓮男坌院痛菩曰ㄑ?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)序列中各鑒定到數(shù)個(gè)ATP合成酶編碼基因，在雄性花芽?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)序列中發(fā)現(xiàn)1個(gè)WD家族蛋白編碼的基因。這些序列有可能作為SlY-1或者DD44的同

9、源基因而定位于性染色體上，是在性別決定過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的基因。
　?、什顪p文庫(kù)中篩選得到3個(gè)與動(dòng)物性別決定基因相關(guān)的ESTs: Sex-lethal介導(dǎo)雌性特異剪接、起始和維持雌性特征的發(fā)育;導(dǎo)致小鼠雄性連鎖的腭裂的CASK基因和小鼠維持雄性性征的H-Y基因。思考，植物性別決定和動(dòng)物的性別決定是否存在部分共同的機(jī)制聯(lián)系。
　?、瞬捎肦eal-time PCR方法，從銀杏雌雄花芽正反差減文庫(kù)篩選的差異ESTs中，隨機(jī)挑選

10、15個(gè)，研究來(lái)自銀杏雌雄花芽中差異基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，7個(gè)雌性花芽?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)序列在雌性花芽中的表達(dá)量明顯高于雄性花芽，1個(gè)雌性花芽?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)序列表達(dá)量較低，且在雌雄花芽之間差異不明顯。7個(gè)雄性花芽?jī)?yōu)勢(shì)表達(dá)序列均表現(xiàn)出在雄性花芽中明顯高于雌性花芽的表達(dá)模式。驗(yàn)證了抑制性差減雜交得到的差異表達(dá)序列的可靠性。
　?、虣z測(cè)差異表達(dá)序列在銀杏雌性和雄性基因組中的分布情況發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)序列沒有在雌、雄基因組之間表現(xiàn)出分布差異。CH11和CH1