姜黃素抗As-,2-O-,3-誘變性及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的初步研究.pdf

1、研究目的 1.研究姜黃素抗三氧化二砷(As2O3)誘變性的作用及其劑量效應(yīng)。2.研究單用姜黃素及與As2O3合用抑制人肝癌細(xì)胞HepG2、人胃癌細(xì)胞SGC7901生長(zhǎng)并誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞HeLa凋亡的作用，及其對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)周期的影響。 3.探討姜黃素抗突變、抗腫瘤作用，為研制開(kāi)發(fā)抗誘變藥品和保健品以及臨床上聯(lián)用姜黃素與As2O3抗腫瘤治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法 1.姜黃素抗As2O3的誘變性研究

2、 (1)小鼠骨髓細(xì)胞微核(MN)實(shí)驗(yàn)。各組分別用色拉油或各濃度姜黃素溶液連續(xù)灌胃7天后，腹腔注射生理鹽水或As2O3溶液，處死前4h各組腹腔注射秋水仙素液。直接涂片法制片，染色后雙盲法閱片，計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，并記錄含有MN的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MN率。 (2)體外人外周血淋巴細(xì)胞MN實(shí)驗(yàn)。無(wú)菌操作培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞24h后，各組分別加入各濃度As2O3溶液及(或)姜黃素溶液。44h后加入秋水仙素液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，

3、空氣干燥法制片。染色后雙盲法閱片，計(jì)數(shù)含有1000個(gè)淋巴細(xì)胞，并記錄含有MN的淋巴細(xì)胞數(shù)，計(jì)算MN率。 2.姜黃素和As2O3聯(lián)用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究 (1)姜黃素與As2O3對(duì)SGC7901和HepG2兩種細(xì)胞株生長(zhǎng)和凋亡的影響。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901及HepG2細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，各組加入無(wú)血清培養(yǎng)基或各濃度As2O3溶液及姜黃素溶液。加藥24h后，在光鏡下觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，采用

4、MTT法檢測(cè)各孔的光密度(OD)值，并計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。 (2)姜黃素與As2O3對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期的影響。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，各組加入無(wú)血清培養(yǎng)基或各濃度As2O3溶液及姜黃素溶液；加藥24h后，在光鏡下觀察各組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，采用流式細(xì)胞儀(FCM)碘化丙啶(PI)單染法檢測(cè)單用姜黃素及As2O3合用對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡率及其細(xì)胞周期的影響，計(jì)算凋亡率。 研究結(jié)果

5、 1.小鼠骨髓細(xì)胞MN實(shí)驗(yàn) As2O3組小鼠骨髓細(xì)胞的MN率最大；As2O3+中濃度姜黃素組，小鼠骨髓細(xì)胞的MN率最低。與空白對(duì)照組比較，As2O3+中、低濃度姜黃素組有顯著性差異(p＜0.05)，As2O3組及As2O3+高濃度姜黃素組均有更顯著性差異(p＜0.01)。 2.人外周血淋巴細(xì)胞MN實(shí)驗(yàn) 各濃度As2O3組隨As2O3濃度的增加，人外周血淋巴細(xì)胞的MN率增大。與空白對(duì)照組比較，各濃度As2O

6、3組有顯著性差異(p＜0.01)。與1μg/ml組比較，10μg/ml姜黃素組+1μg/mlAs2O3有顯著性差異(p＜0.05)，20μg/ml姜黃素組+1μg/mlAs2O3有更顯著性差異(p＜0.01)；與2μg/mlAs2O3組比較，10μg/ml姜黃素組+2μg/mlAs2O3有顯著性差異(p＜0.05)，20μg/ml姜黃素組+2μg/mlAs2O3有更顯著性差異(p＜0.01)；與4μg/mlAs2O3組比較，20μg/m

7、l+4μg/mlAs2O3姜黃素組有顯著性差異(p＜0.05)，10μg/ml姜黃素組+4μg/mlAs2O3有更顯著性差異(p＜0.01)。 3.藥物對(duì)癌細(xì)胞形態(tài)的影響 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，As2O3組及As2O3+各濃度姜黃素組均可見(jiàn)部分SGC7901、HepG2及HeLa細(xì)胞變小變圓，出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)等細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變。 4.藥物對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，姜黃素組中40μmol/l姜

8、黃素對(duì)細(xì)胞SGC7901及HepG2的生長(zhǎng)抑制率最大；As2O3組隨As2O3濃度增加對(duì)細(xì)胞SGC7901及HepG2的生長(zhǎng)抑制率增大，姜黃素與As2O3合用可增加單用對(duì)細(xì)胞SGC7901及HepG2的生長(zhǎng)抑制率。與空白對(duì)照組比較，5、10μg/ml姜黃素組，5μg/mlAs2O3組，5μg/ml姜黃素+0.5μmol/lAs2O3組對(duì)SGC7901細(xì)胞有顯著差異(p＜0.05)，其余各組均有更顯著性差異(p＜0.01)。5μg/ml姜

9、黃素+0.5μmol/lAs2O3組對(duì)HepG2細(xì)胞有顯著差異(p＜0.05)，其余各組均有更顯著性差異(p＜0.01)。 5.藥物對(duì)癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，各濃度姜黃素組、As2O3與各濃度姜黃素合用組隨姜黃素濃度增加，HeLa細(xì)胞的凋亡率越大。與空白對(duì)照組比較，5μg/ml姜黃素組有顯著性差異(p＜0.05)，其余各組均有更顯著性差異(p＜0.01)。此外，與空白對(duì)照組相比，As2O3組及

10、As2O3+各濃度姜黃素組均使G0/G1期細(xì)胞數(shù)量明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞周期被不同程度地阻滯于G1期。 研究結(jié)論 1.As2O3具有致突變的作用，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。 2.姜黃素具有顯著的抗As2O3誘變性的作用。 3.各濃度As2O3及各濃度姜黃素均可抑制SGC7901、HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡，并呈一定的量效關(guān)系。 4.各濃度姜黃素與As2O3合用可增強(qiáng)其單獨(dú)應(yīng)